1.1.1 MAF-1A的化学合成 抗菌肽MAF-1A序列为KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用FMOC固相合成法合成, 高效液相色谱(HPLC)纯化、液相色谱-质谱(LC-MS)验证, 多肽合成纯度≥ 98%。

1.1.2 细胞和病毒 狗肾细胞(MDCK细胞)购自中国医学科学院基础医学院研究所; 甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 为本室保存。

1.1.3 主要试剂 胎牛血清购自德国PAN公司; 神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; RNAiso Plus试剂盒、逆转录试剂盒(PrimeScript^TM RT Master Mix)、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ )均购自TaKaRa(大连)有限公司; 四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北京博奥拓达科技有限公司; 磷酸奥司他韦购自上海麦克林生化科技有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 引物合成 委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成IAV的qRT-PCR检测基因和内参基因引物HA-F:CCTG CTCGAAGACAGCCACAACG, HA-R:GCTCCCTCAGCTCCTCATAGTCG; GAPDH-F:AGGGCAATGCCAGCCC-CAG CG, GAPDH-R:AGGGCAATGCCAGCCCC-AGCG。

1.2.1 MAF-1A抗IAV活性检测

1.2.1.1 病毒的增殖 按文献[16]方法, 将IAV稀释液接种于9日龄鸡胚尿囊腔, 37 ℃培养箱内孵育至48 h, 收获尿囊液, 检测血凝效价。

1.2.1.2 MDCK细胞培养 MDCK细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养, 待细胞生长至70%~90%, 取0.5%胰蛋白酶进行消化成单个细胞, 按2× 10⁴个∕ 孔接种于96孔板, 待细胞生长至90%单层细胞时备用。

1.2.1.3 病毒对MDCK细胞半数感染量(TCID₅₀)测定 将上述96孔板生长的MDCK细胞, 去培养液, PBS洗涤3次, 将病毒液以10倍系列稀释, 分别以100 μ L/孔接种于单层MDCK细胞, 2 h后去掉病毒液, PBS缓冲液洗涤3次, 加入等量细胞维持液, 每个稀释度重复6个复孔, 设细胞培养组为阴性对照, 48 h后观察并记录细胞的病变效应; 并参照文献[17]方法, 按Reed-Muench法计算病毒对细胞的半数感染量TCID₅₀。试验共重复3次。

1.2.1.4 MAF-1A对IAV半数有效浓度(EC₅₀)检测 取100× TCID₅₀病毒稀释液50 μ L与等体积MAF-1A溶液混匀, 使MAF-1A终浓度为15.6 μ g/mL、31.2 μ g/mL、62.5 μ g/mL、125 μ g/mL、250 μ g/mL、500 μ g/mL。将混合液于37 ℃预处理30 min后, 接种于单层MDCK细胞, 2 h后去除液体, PBS缓冲液洗涤3次, 以100 μ L/孔加入细胞维持液, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养48 h, 镜下观察细胞CPE效应; MTT法检测MAF-1A抗病毒有效率。同时, 设置细胞培养组和病毒组为对照组, 奥司他韦为药物对照组, MAF-1A对流感病毒抑制率(%)按公式计算, 并参考文献[18], 采用Probit回归法计算半数有效浓度EC₅₀:

有效率=[(药物组OD-病毒组OD)/(阴性对照组OD-病毒组OD)]× 100%

1.2.1.5 qRT-PCR检测MDCK细胞内的病毒载量 取100× TCID50病毒稀释液50 μ L与等体积MAF-1A溶液混匀, 使MAF-1A终浓度为250 μ g/mL、125 μ g/mL、62.5 μ g/mL、31.2 μ g/mL、15.6 μ g/mL。将混合液于37 ℃预处理30 min后, 接种于6孔板中90%单层MDCK细胞, 2 h后去混合液, 用PBS缓冲液洗涤3次, 每孔加入100 μ L细胞维持液, 于37 ℃, 5% CO₂培养箱中继续培养24 h后, 根据 TaKaRa公司的 RNAiso Plus 和PrimeScript^TM RT Master Mix试剂盒使用说明书, 提取细胞Total RNA并逆转录为cDNA, 于-20 ℃保存备用。参考文献[19], 使用qRT-PCR 反应试剂盒以管家基因GAPDH为内参, 采用2^{-Δ Δ Ct} 法对HA基因 mRNA 水平进行相对定量。反应条件为:95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环。

1.2.2 MAF-1A对 MDCK细胞的毒性检测 将MDCK细胞以2× 10⁴个/孔接种于96孔板, 待其长成90%单层细胞备用; 将MAF-1A溶液进行倍比稀释至10~2 500 μ g/mL, 以上浓度梯度的MAF-1A以每孔100 μ L加入细胞中, 每个浓度设置6个复孔, 并设正常对照组(只加入细胞维持液), 置CO₂培养箱中培养至24 h后倒置显微镜下观察 CPE。弃孔内培养基后用 PBS 洗涤 3 遍, 以10 μ L/孔加入5 mg/mL的MTT液, 继续培养4 h后去上清液, 每孔加入DMSO 150 μ L, 振荡摇匀15 min, 在酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度值(OD), 按公式计算 MAF-1A对MDCK细胞的抑制率^[18]。

抑制率=[1-(药物处理组OD值-调零孔OD值) /(阴性对照组OD值-调零孔OD值)]× 100%。

1.2.3 MAF-1A抗流感病毒作用机制分析

1.2.3.1 MAF-1A对IAV形态结构的影响 按文献[20]方法, 采用醛化鸡红细胞吸附释放法对含甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 鸡胚尿囊液进行纯化, 并检测纯化后病毒的血凝效价。将纯化的病毒液50 μ L与等体积MAF-1A系列稀释液充分混合, 37 ℃孵育30 min, 用0.1%甲醛溶液于37 ℃灭活48 h, 以2%磷钨酸负染色液进行染色, 经透射电镜观察病毒形态结构。

1.2.3.2 血凝抑制试验 将25 μ L不同浓度的MAF-1A 与等体积4倍血凝效价的病毒液混合, 于室温孵育30 min后, 每孔加入1% cRBC悬液50 μ L, 室温(20 ℃~25 ℃)静置40 min后观察结果, 每个浓度作3个复孔。同时, 设置病毒组和PBS阴性对照组, 试验重复3次。

1.2.3.3 神经氨酸酶抑制试验 按试剂盒说明书操作, 在96孔荧光酶标板内每孔加70 μ L神经氨酸酶检测缓冲液, 然后每孔加入 10 μ L 神经氨酸酶, 再每孔加入10 μ L各浓度的MAF-1A, 振动摇匀 1 min 后于 37 ℃ 孵育2 min; 加入10 μ L 的神经氨酸酶荧光底物, 再振荡 1 min, 37 ℃ 孵育 20 min 进行荧光测定。根据试剂盒方法计算出样品对神经氨酸酶的抑制百分比。

1.2.4 统计学处理 数据以( x¯± s)表示, 采用SPSS20.0软件以方差分析检验各组间的统计学差异, P< 0.05 为具有统计学意义。

经检测发现, 甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 在鸡胚中扩增后, 其血凝效价为1∶ 1 280; 甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 对MDCK细胞的TCID50为1.0× 10^-5.2/mL。

MTT结果显示, 当MAF-1A的浓度达2 500 μ g/mL时, 仍对MDCK细胞的生长无明显抑制作用; 镜下可见, 经MAF-1A作用后细胞的形态和结构完整性与对照组相比未见明显差异。MAF-1A 对MDCK细胞表现出较小的细胞毒性。

镜下可见, 甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 可导致 MDCK 细胞变圆, 坏死脱落, 漂浮在培养液表面。但随MAF-1A浓度的增高, 甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 病毒所致的CPE不断减弱, 当浓度达500 μ g/mL时, MDCK细胞完整性好, 形态规则, 正常细胞数量与阴性对照组无明显差异(图1)。经MTT法检测, MAF-1A具有抗甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 活性, MAF-1A对病毒的EC50值为(89.8± 2.97)μ g/mL, 且浓度越大, 对甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 的抑制率越高(图2)。qRT-PCR检测结果显示, 与IAV组比较, 不同剂量(250 μ g/mL、125 μ g/mL、62.5 μ g/mL、31.2 μ g/mL、15.6 μ g/mL)的MAF-1A显著抑制了IAV HA mRNA的表达(t=7.39、6.66、5.78、4.75、5.26, P< 0. 01), 并呈剂量依赖性(图3)。

图1

Fig.1

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	图1 MAF-1A抑制流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 在MDCK细胞中诱导的CPE(× 400) MAF-1A浓度为A:0 μ g/mL; B:125 μ g/mL; C:500 μ g/mL; D为阴性对照组。Fig.1 MAF-1A inhibited the influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus induced CPE in MDCK cells(× 400)

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 MAF-1A抗甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)活性Fig.2 Inhibition rate of the influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus by MAF-1A

图3

Fig.3

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	图3 MAF-1A处理后甲型流感病毒HA基因mRNA水平的变化 (A)MAF-1A(μ g/mL) (B)奥司他韦 注:* * 与IAV组比较P< 0.01。Fig.3 The mRNA level of influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus HA gene after treatment with MAF-1A

透射电镜检测结果显示, 未经药物处理的病毒对照组病毒颗粒结构完整, 而在MAF-1A的作用下, 病毒的结构出现变化, 随着MAF-1A作用浓度升高, 变化更加明显, 当浓度达500 μ g/mL时, 病毒颗粒被完全破坏(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 不同浓度MAF-1A对甲型流感病毒H1N1形态结构的影响(× 30 000) MAF-1A浓度为A: 0 μ g/mL; B: 125 μ g/mL; C:250 μ g/mL; D:500 μ g/mL。Fig.4 Effects of MAF-1A on morphological structure of virus(× 30 000)

MAF-1A对流感病毒引起的鸡红细胞凝集具有明显抑制作用, 当浓度为1.56 μ g/mL时即可抑制流感病毒引起的鸡红细胞凝集(图5A)。而MAF-1A与鸡红细胞单独作用时, 不会引起鸡红细胞的凝集(见图5B)。

图5

Fig.5

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	图5 MAF-1A血凝抑制试验 A:实验组; B:MAF-1A对照组Fig.5 Hemagglutinin inhibition assay for MAF-1A

结果显示, MAF-1A与阳性对照药物奥司他韦相似, 也具有抑制甲型流感病毒神经酸酶的作用, MAF-1A浓度增高, 抑制效果越明显, 其半数抑制浓度IC₅₀为(134.7± 10.31)μ g/mL(图6)。

图6

Fig.6

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	图6 MAF-1A对神经氨酸酶活性的影响Fig.6 Neuraminidase inhibition assay for MAF-1A