The coding region ofα-19 was obtained by PCR. Transforming the recombinant vector into E.coli Rosetta (DE3) and IPTG induced expression. Immunized mice with the designed synthetic peptide by cell fusion and preparation of specific monoclonal antibody.The monoclonal antibodies(mAb) against α-19 giardin with the advantages of high affinity and specificity were pre-pared by using hybridoma technology. Western blot was used to verify the specificity and affinity of the antibodies. Subcellular localization of α-19-giardin by immunofluorescence with the most specific monoclonal antibody.The recombinant plasmid pET28a (+)-α-19 was successfully constructed by gene sequencing.The relative molecular weight of recombinant α-19 Giardia protein was 49 kDa by SDS-PAGE. Western blot results showed that the mAb secreted by a monoclonal hybridoma cell line α-19-3-7-3-5 with the highest specificity with nativeα-19 giardin protein and used for immunofluorescence analysis. The results of confocal microscopy showed that α-19 giardin was located in the ventral flagella of the trophozoites of Giardialamblia.
蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia, 简称贾第虫), 是一种世界性分布的条件致病性原虫, 属于双滴虫目, 六鞭毛科, 贾第虫属, 具有2个细胞核, 是一种非常原始的单细胞真核生物, 具有较大的研究价值[1]。贾第虫通过具有抵抗力但无运动能力的包囊经粪口传播感染宿主, 在小肠转变为具有运动能力的滋养体, 滋养体依靠鞭毛在肠腔中游动, 依靠腹吸盘吸附在肠粘膜上并不断增殖, 损伤肠绒毛, 影响宿主的消化吸收, 引起蓝氏贾第鞭毛虫病(Giardiasis, 简称贾第虫病), 主要症状为腹泻[2]。贾第虫病有较强的传染性以及较高的发病率, 在医疗卫生条件差的国家和地区常呈暴发性流行, 常引起旅行者产生腹泻, 被称为“ 旅行者病” [3]。在我国南方患病率更高, 近年相关报道南方人群贾第虫总体感染率为1.20%, 慢性腹泻和饲养宠物是蓝氏贾第鞭毛虫感染的危险因素, 由于卫生水平的提高, 我国贾第虫感染率总体上处于较低水平[4]。贾第虫具有极其复杂的细胞骨架系统, 是与致病相关的关键结构— — 鞭毛和腹吸盘的主要蛋白成分, 因而贾第虫复杂的细胞骨架系统与贾第虫的致病性相联系[5, 6, 7, 8]。
贾第素是贾第虫一种特有的骨架蛋白[9, 10], 分为α 、β 、γ 、δ 4大类, 其中α 贾第素家族是其中数量最多的一族, 有21个成员, 按照发现时间命名, 从α -1到α -19(α -7 细分为 3 种变体)[11, 12, 13]。目前认为, 目前α 贾第素是高等真核生物膜联蛋白Annexin的类似物[14], 膜联蛋白是一种保守的钙依赖性磷脂结合蛋白, 该蛋白广泛存在于各种动植物中, 被认为有可能参与细胞骨架运动、细胞信号转导、细胞繁殖与分裂、膜的融合等多种的细胞生理活动。但是大多数真核生物仅有一种或几种膜联蛋白家族成员, 作为一种低等真核生物, 贾第虫拥有如此众多膜联蛋白类似物成员, 这些成员在具体功能和发挥作用的方式上有何不同, 至今尚无解释。明确未知功能蛋白的亚细胞定位, 对于推测理解其功能具有很大的意义。α -19贾第素是α 贾第素家族研究较少的一个成员[15], 是该家族中为数不多未被定位的贾第素, 国内也没有相关的研究。本研究拟从α -19贾第素蛋白的克隆表达入手, 制备α -19贾第素特异性单克隆抗体并鉴定其亚细胞定位, 从而为α -19贾第素相关功能以及疾病防治的研究提供材料。
C2株第贾第虫、小鼠骨髓瘤细胞系(Sp2/0)、原核表达质粒pET-28α (+)、大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株均由实验室保存; 大肠杆菌E.coli TOP10菌株购自昂羽上海生物技术有限公司; 兔抗His-Tag多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG抗体、Ni— NTA预装柱和Protein G Sefinose预装柱购自上海生工生物技术有限公司; T4 DNA连接酶、限制性内切酶NcoⅠ 、XhoⅠ 购自宝生物工程(大连)公司; 2× Pfu PCR MasterMix、血液基因组DNA提取试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、DAB显色试剂盒购自天根生物科技公司; PAGE凝胶快速制备试剂盒购自雅酶生物公司; 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、融合用PEG1450、HT和HAT培养基购自Sigma-Aldrich公司; 引物合成及测序工作、抗原肽合成和KLH偶连工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
奥林巴斯CKX31倒置显微镜、上海智诚ZHJH— C1112B超净工作台、Sigma 3K30台式低温高速离心机、Heraeus X1R台式低温高速离心机、HH— W恒温水浴箱、SHELLAB2406 CO2孵箱、9512AA2Y低温循环水浴、伯乐iMARK酶标仪、Omega Lum W 化学发光多色荧光成像系统、Scandrop2000超微量核酸蛋白测定仪、伯乐T100PCR扩增仪、DYY一6C稳压稳流电泳仪、雅马拓SQ510C高压蒸汽灭菌锅、ZHWY一100D气浴振荡摇床、Leica SP8 STED 3× 激光扫描共聚焦显微镜。
1.3.1 α -19贾第素的原核表达[16, 17] 根据GenBank上WB株贾第虫α -19贾第素基因序列(XM_001704791.1)设计上游引物(5'-CATGCCATGGCCATGGGTTGTGCCGCATCAACTC-3') 和下游引物(5'-CCGCTCGAGGTCGCCGCGGGGAGTC-3'), 上、下游引物分别含有NcoⅠ 、XhoⅠ 酶切位点(为下划线部分)。提取贾第虫全基因组DNA, 以其为模板, PCR扩增目的序列, 反应条件为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 重复30个循环; 72 ℃延伸10 min。胶回收试剂盒回收目的片段PCR产物。胶回收产物经NcoⅠ 和XhoⅠ 双酶切后与同样酶切的 pET-28α (+)载体按摩尔比 4∶ 1混合, 16 ℃连接反应 4 h。连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞, 通过卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆, 阳性克隆提质粒, 进行双酶切鉴定, 鉴定结果正确的克隆送生物公司测序。
1.3.2 α -19贾第索重组蛋白的诱导表达和鉴定 将测序鉴定正确的质粒转化原核表达菌株E.coli Rosetta(DE3), 涂于卡那霉素和氯霉素的双抗平板上, 37 ℃过夜培养, 挑取阳性单菌落转接于含双抗的液体LB培养基中。37 ℃震荡培养过夜, 再将所得菌株进行检测, 序列正确者进行接下来的操作, 按1%的接种量转移到3管3 mL新鲜双抗LB培养基中, 置于37 ℃震荡培养, 当OD600值达到0.6时3管分别加入终浓度0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30 ℃诱导表达5 h。12 000 r/min离心1 min收集菌液, 用无菌水重悬, 按比例加入4× SDS 上样缓冲液煮沸裂解获得全菌体蛋白, 以未经诱导的转化菌为对照, Western blot和SDS-PAGE双重鉴定目的蛋白表达结果是否正确。Western blot以兔抗 His-Tag兔源多克隆抗体(1∶ 1 000)为一抗, 以HRP标记的羊抗兔IgG(1∶ 5 000)为二抗, 经DAB显色观察结果。
1.3.3 α -19贾第素抗原肽的设计[18] 根据GenBank提供的α -19贾第素的蛋白序列, 通过Clustal_X软件将α -19贾第素的氨基酸序列与其他α 贾第素家族成员进行同源性比较, 选择同源性最低的区段, 采用DNASTAR、SYFPEITHI, Bcepred等生物学软件和网站分析所选肽段的抗原活性, 应用BLAST比对分析抗原肽与其他贾第虫蛋白的同源性。设计好的抗原肽由生工生物公司合成并与KLH偶联。
1.3.4 小鼠免疫 取3只7周龄左右健康雌性BALB/c小鼠, 首次免疫时将合成抗原肽与KLH偶联, 用等体积的弗氏完全佐剂混合乳化, 以50 μ g/只剂量对小鼠进行多点皮下注射。初此免疫后每间隔2周免疫1次, 共免疫5次。在第5次免疫后1周后, 断尾采血, 收集少量血清进行效价测定。然后对血清效价最高的免疫小鼠进行加强免疫。在进行加强免疫3 d后, 取脾脏细胞准备融合[19, 20, 21]。
1.3.5 细胞融合及杂交瘤细胞株的筛选 以PEG1450为融合剂, 将小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞(Sp2/0)按照10∶ 1比例进行细胞融合。以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞, 分装于96孔板, 在HAT选择培养基中于5% CO2、37 ℃条件下培养。5 d后更换新鲜HAT营养液, 8 d后用HT培养基更换HAT培养基。待细胞覆盖孔底面积约1/4~1/3时, 用合成抗原肽0.5 μ g包被酶标版, 间接ELISA法检测培养上清中抗体效价, 阳性判断标准(OD阳/OD阴> 2.5∶ 1), 以Sp2/0的培养上清与正常BALB/c小鼠的血清作为阴性对照。对检出的阳性孔进行2~3轮有限稀释亚克隆培养, 直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100%时, 即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株, 及时扩大培养并冻存。
1.3.6 含mAb腹水的制备及纯化 选取效价最高的3株阳性杂交瘤细胞, 用不含血清的培养液混匀, 腹腔注射BALB/c小鼠, 每只5× 105个。接种杂交瘤细胞后约10~15 d, 抽取腹水, 用Protein G预装柱通过亲和层析纯化抗体。
1.3.7 mAb结合力和特异性的验证 将α -19贾第素原核表达质粒转化E.coli Rosetta(DE3), 经最适浓度IPTG诱导表达后全菌体裂解物上样, 对照组为未诱导的转化菌裂解物, 通过 Western blot验证所制备抗体的结合能力; 利用贾第虫滋养体全裂解物通过Western blot 验证具有较好结合力的抗体的抗原特异性。
1.3.8 免疫荧光鉴定α -19贾第素的亚细胞定位[21, 22] 将对数生长期的贾第虫滋养体接种于放有无菌盖玻片和改良TYI-S-33培养基的12孔板中, 37 ℃培养4 h, 取出盖玻片, 室温条件下用4% 的多聚甲醛固定, PBS洗涤后再滴加 0.5% 的聚乙二醇单辛基苯基醚(Triton X 100)室温透化, 5% BSA溶液室温封闭1 h。加入1∶ 200稀释的小鼠抗α -19贾第素单克隆抗体, 置于湿盒中4 ℃过夜孵育。次日用PBS洗涤后放入1∶ 2 000稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG中, 室温避光孵育1 h。DAPI封片剂封片后共聚焦显微镜观察荧光定位。
以贾第虫基因组DNA为模版克隆a-19贾第素编码区, PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 可见约1 260 bp的特异性条带, 与预期大小相符(图1)。将α -19贾第素双酶切后连入原核表达质粒pET-28α (+), 提取质粒NcoI和XhoI酶切鉴定后电泳结果显示可见约1 260 bp的α -19贾第素目的片段、5 300 bp的载体pET28α (+)2条电泳条带(图2), 与预期结果一致。
转化有重组质粒的菌液加入终浓度0.1、0.5、1.0 mmol/L 的IPTG 30 ℃诱导5 h后取少量菌液进行SDS-PAGE电泳, 结果显示诱导组在约49 kD处出现目的条带, 在0.5 mmol/L的IPTG诱导下, 重组蛋白表达最明显, 而未加IPTG 诱导的pET28α (+)-α -19转化菌则无此条带(图3), Western blot证实该条带为α -19-His tag重组蛋白(图4)。
采用多种生物信息学软件和网站对α -19贾第素蛋白序列进行分析, 最终选定一段18aa的短肽(364-381aa)作为抗原肽, 序列为IDRPKDPAAGPEAENGPA。将该段合成抗原肽与KLH偶联后, 免疫BALB/c小鼠, 4 次免疫结束后, 间接 ELISA 法检测小鼠血清抗体效价最高达1∶ 64 000, 满足细胞融合条件。细胞融合后经多轮亚克隆筛选获得3株产生抗体效价比较高的单克隆细胞株α -19-3-7-3-5、α -19-3-14-3-2、α -19-3-17-1-1。将3株杂交瘤细胞分布接种小鼠腹腔获得腹水, 亲和层析纯化获得3种单克隆抗体用于下一步结合力和特异性验证实验。
采用原核表达的α -19贾第素蛋白验证mAb的结合能力, 贾第虫滋养体全裂解物验证α -19 mAb的特异性。结合性实验结果显示3-7-3-5、3-14-3-2、3-17-1-1杂交瘤产生的抗体均能和α -19贾第素重组蛋白结合; 特异性实验显示3-7-3-5杂交瘤产生的抗体特异性良好, 与贾第虫滋养体裂解物反应仅出现α -19贾第素单一条带, 3-14-3-2杂交瘤产生的抗体出现非特异条带, 3-17-1-1杂交瘤产生的抗体未能与贾第虫裂解物中的天然α -19贾第素蛋白发生反应(如图5、图6), 故选择3-7-3-5用于定位研究。
贾第虫滋养体爬片用α -19mAb 3-7-3-5的一抗和Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠的二抗处理后, 在共聚焦显微镜下观察贾第素α -19贾第素的分布。结果显示, 绿色荧光集中分布于滋养体的一对腹鞭毛上(图7)。
本研究首先对α -19贾第素进行了原核表达, 但表达出来的重组α -19贾第素蛋白并未直接用作免疫原去制备单克隆抗体, 而是用于α -19 mAb体外结合能力的验证。为了保证产生的抗体能够用于免疫荧光实验, 我们通过多种生物信息学网站和软件对α -19贾第素蛋白的天然抗原决定簇部位以及空
间构象进行分析, 选出了几段备选肽段。但α 贾第素家族成员之间具有很高的同源性, 为了避免交叉反应, 我们又将备选肽段在各贾第素家族成员间进行序列比对, 最后确定出了这个最理想的抗原肽用于mAb的制备。相对于多克隆抗体, 单克隆抗体在诸多方面有着明显的优势, 其特异性高、不易产生交叉反应或假阳性反应, 背景染色较浅, 制备成功后可获得恒定的再生源, 是进行定位研究的首选, 但其制作过程繁琐、制备技术要求高、稳定性差、成本高、周期长也增加了单克隆制备的难度。本实验主要应用免疫荧光技术进行亚细胞定位, 所需抗体特异度较高, 抗体用量较多, 要求定位结果的一致性和标准化, 而单克隆抗体正是最优的选择[19, 20, 21, 22]。
贾第虫的骨架蛋白中的α -贾第素家族是一类含有酸性磷脂的钙依赖性膜结合蛋白, 共有21个成员, 其在蛋白表达水平、亚细胞定位以及生物学功能上有很大差异[23, 24], 某些α 贾第素如α -4、α -8、α -11等因表达过量可以影响细胞的分裂增殖分化而导致细胞死亡[25, 26], 说明α 贾第素家族成员都具有至关重要的生物学功能, 但是各种成员间的功能又不完全相同, 明确每一种贾第素的具体功能将是一个非常有有趣的工作, 对于全面理解膜联蛋白成员的功能具有重要意义。随着α -19贾第素定位的确立, α -贾第素家族21种贾第素定位基本被阐述清楚, 其中腹鞭毛定位的贾第素种类最多, 包括α -5、α -9、α -10、α -17以及我们鉴定的α -19贾第素[27]。鞭毛是贾第
虫滋养体最重要的运动器官, 参与虫体的吸附和脱离小肠粘膜表面的过程, 甚至还被证明参与虫体的摄食[28]。为何如此众多的α 贾第素成员定位于腹鞭毛, 而其它鞭毛定位的α 贾第素成员相对较少?这些定位相同的贾第素在功能上有何差异?目前这些问题的答案均无相关报道, 有待于进一步研究。
在本研究中, 我们成功制备了针对α -19贾第素的特异性单克隆抗体, 并利用免疫荧光技术证实α -19贾第素定位于一对腹鞭毛, 这些结果为该贾第素的功能研究提供了必要的实验材料和支持。
利益冲突: 无
引用本文格式:李汶霖, 李淑凝, 沈海娥, 等.蓝氏贾第鞭毛虫α-19贾第素的单克隆抗体制备与亚细胞定位研究[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(10):801-806. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.107
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