基于RNA-seq分析戊型肝炎病毒感染HepG2细胞后的差异表达基因
唐媚娜, 何伟, 肖卫红, 熊银, 饶亚华, 胡志敏
华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院医学检验科,武汉 430022
通讯作者:胡志敏,Email: mycohu@163.com; ORCID:0000-0002-9360-1686
摘要
目的 研究戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染人肝癌细胞HepG2前后,HepG2细胞的相关基因表达变化,为初步探索HEV在宿主细胞内感染机制及致病机理奠定基础。方法 对HEV感染组HepG2细胞和对照组HepG2细胞的RNA进行高通量测序(RNA-seq技术),利用生物信息学方法对测序数据进行分析,对感染组和对照组的差异表达基因进行筛选、功能注释和通路富集分析。结果 以基因表达差异倍数在2倍及以上为标准,从感染组与对照组共筛选出差异表达基因132个,其中,感染组相比于对照组,上调表达基因127个,下调表达基因5个。Gene Ontology(GO)功能富集分析注释结果显示,差异表达基因主要富集在病毒防御反应、固有免疫应答、病毒基因组复制的负调控及干扰素应答等过程;主要行使RNA结合、蛋白结合、调节解旋酶活性、NAD+ ADP-核糖基转移酶的活性等分子功能。利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要参与甲型流感、单纯疱疹感染、麻疹、C型肝炎、RIG-I样受体信号通路、病毒致癌、乙型肝炎、Toll样受体信号通路、胞质DNA传感通路、趋化因子信号转导通路和细胞凋亡等通路。结论 通过功能及通路筛选,发现DDX58、STAT1、CXCL8、STAT2、TLR3、CXCL10、EIF2AK2、IRF9和IFIH1等基因可能在HEV感染抗病毒免疫过程中发挥重要作用。
关键词: HEV; HepG2细胞; RNA-Seq测序; 差异表达基因
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)10-0813-08
Analysis of differently expressed genes of hepatitis E virus infected HepG2cells using RNA-Seq technique
TANG Mei-na, HE Wei, XIAO Wei-hong, XIONG Yin, RAO Ya-hua, HU Zhi-min
Department of Medical Laboratory, Affiliated Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital of Tongji Medical College Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, China
Corresponding author: Hu Zhi-min,Email: mycohu@163.com
Abstract

To detect the changes in the expression of hepatitis E related genes in human HepG2 cells infected by HEV, and to lay the foundation for the preliminary exploration of the infection mechanism and pathogenesis of HEV in the host cells. The HepG2 cell RNA from the HEV infected group and control group were sequenced by high throughput sequencing (RNA-seq technology), and the analyzed by bioinformatics methods including screening, gene ontology functional enrichment analysis and pathway enrichment analysis of the differentially expressed genes in infected group and the control group. A total of 132 genes with at least 2-fold changes were identified from the infected group and the control group, of which 127 were up-regulated and 5 were down- regulated.The GO functional annotation shows that, the differentially expressed genes are mainly enriched in the process of defense response to virus, innate immune response, negative regulation of viral genome replication and response to interferon, and mainly play function of RNA binding, protein binding, regulation of the activity of helicase and the NAD+ADP-ribosyltransferase. Using the KEGG database as a reference, these genes are mainly involved in the pathway of influenza A, herpes simplex infection, measles, hepatitis C, RIG-I like receptor signaling pathway, virus carcinogenesis, hepatitis B, toll like receptor signaling pathway, cytoplasmic DNA-sensing pathway, chemokine signal transduction pathway and cell apoptosis. In conclusion through enrichment of functions and signaling pathways, it is found that DDX58, STAT1, CXCL8, STAT2, TLR3, CXCL10, EIF2AK2, IRF9 and IFIH1 may play an important role in the process of HEV infection.

Key words: hepatitis E virus(HEV); HepG2 cells; RNA-Seq sequencing; differentially expressed genes

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是引起戊型肝炎(Hepatitis E, HE)的病原体, 经粪-口途径传播。在发展中国家, 戊型肝炎是一个重要的公共卫生问题, 我国是HEV的流行区。HEV是单股正链RNA病毒, 呈球形、直径27~34 nm, 无包膜, 核衣壳呈二十面体立体对称。基因组长约7.2 kb, 3'端有poly A尾, 有3个开放阅读读框(Open Reading Frame, ORF)。HE是一种自限性传染病, 主要导致隐性感染及急性肝炎, 一般不发展为慢性肝炎。戊型肝炎在15~39岁的青年和成人高发, 孕妇罹患率高, 且病情严重, 在妊娠的后3个月发生感染病死率可达20%[1]。有研究表明, 它与器官移植患者、免疫抑制患者以及老年人的戊型肝炎慢性化有关[2, 3]

RNA-Seq, 即RNA测序, 又称转录组测序, 是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术。通过Illumina高通量测序平台, 将RNA反转录为cDNA进行测序, 再通过直接比对该基因组区域的reads数来衡量其转录水平。近年来, 随着大规模测序技术的不断发展, RNA-Seq技术被广泛应用于各类研究领域, 极大地改变了转录组研究的前景[4, 5]。与基因芯片相比, RNA-Seq技术可定量研究RNA的表达水平, 其结果更为准确, 且方便在实验结果间进行直接比较。通过RNA-Seq技术可准确测定特异基因的表达水平、差异剪接和等位基因转录本的特异表达, 来说明许多生物相关的问题[6]。目前RNA-Seq技术广泛应用于差异表达基因的筛选, 并且可用于健康组织与疾病组织之间基因表达差异的研究[7]

为了更好地了解感染后发生的即时变化, 本研究基于RNA测序 (RNA-Seq), 在基因水平上对HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因进行研究, 旨在筛选出与HEV感染相关的候选基因, 从而为今后深人研究HEV感染相关的基因及其功能提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 病毒株与细胞

HepG2细胞株购自上海中科院细胞库。HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒株来自武汉大学基础医学院医学病毒研究所, 滴度约为3× 108 pfu/mL。

1.2 试剂与耗材

DMEM (Dulbecco’ s Modified Eagle Medium)培养基、 胎牛血清(Fetal Bovine Serum)及胰蛋白酶 (Trypsin)均购自GIBCO公司(Grand Island, NY, USA); 总RNA提取Trizol Regent购自Thermo公司(Waltham, MA, USA); 反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with cDNA Eraser购自Takara公司(Shiga, Japan); mRNA纯化试剂盒(Dynabeads mRNA direct Purification Kit)购自Thermo公司; NanoDropND-1000分光光度计购自Thermo公司。

1.3 样品获取、处理与测序

感染前, 将HepG2细胞均匀种植于48孔板, 培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(10% FBS/DMEM), 37 ℃, 5% CO2环境下培养。感染组4孔, 对照组4孔(约 5× 104 cells/孔)。当细胞汇合度达到60%~70%后, 感染组接种5× 103 GE(genome equivalents)/细胞的HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒, 对照组用等量4% PEG8000处理; 感染4 h后, 弃去培养基, 以1× PBS洗涤3次后, 加入新鲜10% FBS/DMEM 维持培养24 h[1 dpi(day(s)post infection)]后, 收取第1批RNA; 继续培养48 h(3 dpi)后, 收取第2批RNA; 继续培养48 h(5 dpi)后, 收取第3批RNA; 继续培养48 h(7 dpi)后, 收取第4批RNA。使用分光光度计检测RNA的OD260/OD280及浓度。将符合纯度及浓度要求的15 μ g RNA用干冰保存送测序。

利用第二代高通量测序技术Illumina Hiseq 2000对HEV感染前后(感染前、后各4组)的HepG2细胞RNA进行转录组测序, 测序由本实验室自行完成。其中HEV-1、HEV-2、HEV-3、HEV-4为感染组, Mock-1、Mock-2、Mock-3、Mock-4为对照组。具体测序程序包括:提取总RNA并纯化mRNA, 将所得到的mRNA随机打断成片段, 再用随机引物和逆转录酶合成cDNA片段, 再对cDNA片段进行末端修复, 并连接测序接头, 富集纯化的cDNA模板后用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer对文库进行质检, 最后上机测序。

1.4 免疫印迹和免疫荧光检测感染细胞病毒表达

使用 2× SDS Sample buffer 裂解上述感染组及对照组(感染4 h后, 弃去培养基, 以1× PBS洗涤3次后, 加入新鲜10% FBS/DMEM 维持培养24 h)细胞 10 min, 超声 5 s× 3 次(无需 100 ℃变性)。使用 BCA 蛋白定量试剂盒进行定量, 取 20 μ g 总蛋白上样(20 μ g/孔)。根据分子克隆所示方法制备 8% SDS-PAGE 分离胶, 5%堆积胶, 以 80 V 恒压电泳。290 mA, 转膜 2 h, 封闭液(5%脱脂牛奶/PBS)封闭 1 h。5%BSA/PBS 稀释的 Anti-pORF2 antibody 室温孵育 1 h(1∶ 5 000)。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜10 min× 2次。5% BSA/PBS 稀释的Anti-IgG-HRP antibody室温孵育1 h。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜 10 min× 3 次, 按 ECL 说明书配制 ECL 液, 孵育膜 5 min。暗室中显影, 根据发光强弱调节压片时间使条带更清晰。

将细胞种植在加有灭菌圆形盖玻片的 24 孔板中(约 1× 105 cells/孔), 按1.3中方法感染细胞, 用 10% FBS/DMEM 培养于 37 ℃, 5% CO2培养箱中。感染4 h后, 弃去培养基, 以1× PBS洗涤3次后, 加入新鲜10% FBS/DMEM维持培养24 h后, 吸去培养基, 用4%多聚甲醛/蔗糖/PBS固定15 min, PBS洗5 min× 2次, 0.1% Triton X-100/PBS 透化10 min, PBS洗10 min× 2次; 5% BSA/PBS封闭30 min; 5% BSA/PBS稀释的Anti-pORF2 antibody室温孵育1 h(1∶ 500); PBS洗5 min× 5次; 5% BSA/PBS 封闭20 min; 5% BSA/PBS稀释的Anti-IgG-cy2 antibody(1∶ 400)室温孵育1 h; PBS洗5 min× 7次; 加入1 μ g/mL的DAPI染核2 min; PBS洗5 min× 2次; H2O洗1次。在载玻片上滴60%甘油4 μ L, 将盖玻片从一侧轻轻粘在载玻片上, 在荧光显微镜上观察pORF2的表达情况, 用激光共聚焦显微镜扫描和照相。

1.5 数据处理与分析

用FastQC分析软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对RNA-seq中测得的Raw data进行质量控制和过滤, 并去除带接头、含有poly-N以及低质量reads形成纯净序列(Clean reads); 将得到的Clean Reads采用STAR软件对RNA-seq数据进行比对(http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/), mapping至人的参考基因组(GRCh38.p6 assembly of the human reference from NCBI, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF), 所得的mapped Reads为有效测序量。

1.6 差异表达基因筛选及基因功能和通路分析

对mapped reads进行基因表达定量, 使用HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count)分别对感染组样本和对照组样本进行reads计数。使用DESeq2(http://genomebiology.com)对感染组和对照组进行基因表达量比较, 以差异倍数(Fold change)绝对值≥ 2且Padj< 0.05(Padj是P值经过多重校验校正后的值)为标准计算出感染组样本和对照组样本的差异表达基因, 并在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对差异表达基因进行GO功能富集分析通路富集分析, 采用Fisher检验计算每个GO的P值, 筛选出差异基因富集的显著性通路(P< 0.05)。

2 结 果
2.1 质量控制和短序列比对

感染组细胞成功感染HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒(图1)。

图1 感染组细胞成功感染HEV
A为HEV感染组和对照组细胞免疫荧光, 感染组成功感染病毒; B为感染组细胞感染后, 1~7 d内的HEV病毒载量; C为 Western Blot检测细胞内病毒pORF2表达情况。
Fig.1 Infected group cells were successfully infected with HEV

从质控结果可知, 8个样本测序结果均合格, 可用于后续生物信息学分析。应用STAR软件对预处理后的reads进行Genome mapping, 将所得到的reads与人的参考基因进行比对(表1)。

表1 感染组与对照组测序reads比对 Tab.1 Reads alignment of infected group and control group

对mapped reads进行基因表达定量, 使用HTSeq分别对实验样本和对照样本进行reads计数, 制作密度散点图R-I (Ratio-intensity, 图2A), 显示HEV感染组和对照组基因表达水平。

2.2 差异表达基因筛选

由主成分分析图(Principal Component Analysis, PCA, 图2B)可以看出, 感染组和对照组在转录水平上具有明显的差异。图2C显示, 以FDR< 0.1 (FDR是对P-value的校正值)且差异倍数绝对值≥ 2(Log2FC≥ 1或Log2FC≤ -1)为条件进行筛选, 共得到132个差异基因, 其中, 上调表达基因127个, 下调表达基因5个。表2列出了差异倍数排名前10的基因列表。

图2 感染组和对照组的基因表达
A为密度散点图, 红点表示HEV感染组的整体表达水平, 黑点表示对照组的整体表达水平; B为主成分分析图, 蓝点表示戊型肝炎感染组, 红点表示对照组; C为戊型肝炎病毒感染细胞与对照细胞差异基因表达的火山图
Fig.2 Gene expression of infected and control groups

2.3 基因GO功能富集分析

如图3A(生物学过程)和3B所示(分子功能), 显示了部分差异表达基因功能富集结果。其中, 横轴代表功能显著性水平(Padj)的-Log10P值; 纵轴代表Gene Ontology数据库中对应GO的条目名称。由结果可知, 在对差异表达基因进行的富集功能分类中, 在生物学过程条目中排名前15位的GO分类分别为:病毒防御、I型干扰素信号通路、病毒基因组复制的负调控、抗病毒、IFN-γ 介导的信号通路、固有免疫应答、IFN-α 应答、I型干扰素产生的负调控作用、IFN-β 应答、IFN-γ 应答、免疫反应、炎症反应、ISG15蛋白共轭、IFN-α 的细胞应答及病毒转录的负调控等; 在分子

表2 差异倍数排名前10的基因列表 Tab.2 List of genes showing top 10-fold-change

图3 差异表达基因GO功能富集分析结果示意图
A为差异表达基因功能富集GO分析(生物学过程)结果示意图; B为差异表达基因功能富集GO分析(分子功能)结果示意图; C为通过DAVID 和KEGG数据库获取的差异表达基因的通路富集分析。
Fig.3 Schematic diagram of GO function enrichment analysis of differentially expressed genes

功能条目中排名前15位的GO分类分别为:双链RNA结合、解旋酶活性、蛋白结合、NAD+ADP-核糖基转移酶的活性、单链RNA结合、2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性、RNA结合、GTP酶活性、锌离子结合、泛素蛋白转移酶活性、同一蛋白结合、信号转导活性、GTP结合、连接酶活性及受体结合等。

2.4 信号通路分析

对差异表达基因通过DAVID及KEGG数据库进行信号通路分析, 以更深入地了解该基因的生物学功能。基于DAVID数据库进行通路注释, 采用Fisher检验筛选差异基因富集的显著性通路(P< 0.05)。如图3C所示, 在对差异表达基因进行的富集功能分类中排名前10的信号通路分别为:甲型流感、单纯疱疹感染、麻疹、C型肝炎、RIG-I样受体信号、病毒致癌、乙型肝炎、Toll样受体信号、胞质DNA传感和趋化因子信号转导通路。

3 讨 论

HEV感染会引起机体产生免疫应答, 免疫应答是机体的重要防御机制, 也是导致宿主细胞损伤继而产生临床症状的关键因素。戊型病毒性肝炎的临床表现从自限性急性病毒性肝炎(AVH)至急性肝功能衰竭(ALF), 病理变化包括免疫细胞浸润和肝细胞坏死、溶解。人类和动物的研究结果均表明, HEV对肝细胞无直接病变作用, 肝细胞的损害并非病毒复制所致, 而是由宿主免疫反应引起的宿主细胞损伤, 病毒诱发的细胞免疫参与了戊型肝炎病毒感染的发病机制[8]。同时临床上观察到戊型肝炎急性期, 患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)在受到ORF2抗原刺激时反应增强, CD4+ T细胞数量升高, 产生干扰素-γ (IFN-γ ) 的量明显高于对照, 推断CD4+ T细胞, 可能参与了戊型肝炎急性患者的肝细胞损伤; 此外, 临床患者在出现转氨酶升高、黄疸等症状时, 伴随抗体上升和病毒载量下降等现象, 也表明了肝细胞损伤与体液免疫和细胞免疫反应有关[9]

本实验通过转录组测序技术, 对HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因进行分析, 共筛选得到差异表达的基因132个, 上调表达基因127个, 下调表达基因5个。通过差异表达基因筛选、GO功能富集分析以及KEGG通路分析, 筛选出几个与抗病毒免疫相关的基因, 与对照组相比, 在HEV感染组表达显著上调, 这些基因可能与HEV感染相关, 参与了宿主抗病毒过程, 可作为候选基因, 作为进一步深入研究的基础。

3.1 DDX58和IFIH1 (RIG-I和MDA5)

DDX58基因编码一种RNA解旋酶, 与许多细胞过程有关, 包括RNA结合和RNA二级结构的改变。它参与病毒双链RNA的识别和免疫应答的调节, 相关通路为DDX58/IFIH1 (RIG-I/MDA5)诱导的IFN-α 和IFN-β 通路。IFIH1, 是DDX58的旁系同源基因, 与DDX58协同作用诱导I型干扰素产生, 发挥抗病毒作用。IFIH1和DDX58与中国汉族人群的慢性丙型肝炎发生相关, 是RNA病毒感染天然免疫应答的重要启动子, 可能在丙型肝炎病毒(HCV)感染结局中起重要作用[10]。结合本文的研究结果, 猜测IFIH1和DDX58可能参与HEV感染过程。RIG-I样受体(RLRs)DDX58和IFIH1是天然抗病毒反应的关键因子。一旦识别出病毒RNA, 它们与MAVS相互作用, 可能诱导产生I型干扰素[11]。DDX58、IFIH1和IFN调节因子1(IRF1)是抗HEV的关键基因, DDX58的基础表达可抑制HEV感染天然配体5'-三磷酸核糖核酸对RIG-I途径的激活可能抑制戊型肝炎病毒的复制, 激活DDX58可刺激细胞通过IFN诱导的JAK-STAT级联信号, 产生对HEV的天然免疫[12]

3.2 STAT1和STAT2

STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化, 形成同源或异源二聚体, 转位到细胞核, 作为转录激活因子发挥作用。 I型干扰素(IFN-α 和IFN-β )与细胞表面受体结合后, 通过蛋白激酶导致Jak 激酶(Tyk2和JAK1)活化, 以及STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化, 磷酸化的STATs二聚体化并与IRF-9 形成一个复合体, 称为ISGF3转录因子, 进入细胞核。ISGF3结合干扰素刺激反应元件(ISRE), 激活干扰素刺激基因的转录(ISG), 促进细胞进入抗病毒状态。

3.3 TLR3

戊型肝炎病毒感染诱导细胞免疫应答主要是通过病原体识别受体(PRRs)实现, 包括维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体和Toll样受体(TLRs)[13, 14]。TLRs在启动固有抗病毒反应中发挥重要作用, 识别病毒RNAs后, 激活下游级联信号, 涉及各种信号分子, 如线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、干扰素调节因子3(IRF3)、IRF7和核转录因子κ B(NF-κ B)[15, 16]。TLRs的特异性配体刺激PBMCs, 可以诱导I型干扰素的产生[17]

I型干扰素, 主要包括 IFN-α 、IFN-β 、 IFN-ε 、IFN-κ 、FN-ω 和IFN-ν 等[18, 19], 是细胞内抗病毒免疫的第一道防线。一旦细胞内发生HEV感染, 病毒基因组被病原体识别受体识别, 导致细胞内信号级联快速激活。Ⅰ 型干扰素的表达诱导一系列干扰素-刺激基因, 帮助细胞对付病毒感染。在感染的细胞中, I型干扰素可直接对抗病毒的感染和复制, 并激活其他免疫细胞, 如自然杀伤细胞, 树突状细胞和Kupffer细胞。在此次研究中, IFI6、IFITM1、IFIH1、IFNL1、IRF9、ISG20、IFI35及IFIT1等多种干扰素诱导蛋白、干扰素诱导跨膜蛋白、干扰素λ 1、干扰素调节因子及干扰素刺激基因表达上调, 说明HEV感染后, 这些基因参与了抗病毒免疫。

TLR3是单次跨膜细胞表面受体, 它识别与病毒感染有关的核酸RNA, 介导有效免疫所需要的细胞因子的产生, 是先天免疫与适应性免疫的关键组成部分。通过TRIF/TICAM1, 诱导NF-κ B的活化和I型干扰素的生产, 刺激细胞因子分泌并促进炎症反应。因此, TLR3可能在宿主防御病毒方面发挥作用。

TLR3和IFN-γ 在戊型肝炎发病机制中起重要作用。能高水平表达TLR3和IFN-γ 的患者能够控制疾病和康复; 而TLR3和IFN-γ 低表达的患者倾向于发展为ALF[20], 与ALF患者相比, AVH患者的TLR3基因表达、抗炎和促炎细胞因子的含量均较高; IFN-γ 、TNF-α 、IL-10和TGF-β 在PBMC培养上清液检测中也较高。沉默TLR3后, 在PBMC培养上清液中IFN-γ 的水平显著降低[20]。在此次研究中, TLR3表达上调, 说明HEV感染后, HEV的RNA会被细胞内的模式识别受体中的TLR3识别, 激活MyD88-非依赖途径信号通路, 激活IRF9, 调节炎性细胞因子IFN-α 及IFN-β 的表达, 产生抗病毒作用。

3.4 CXCL8(IL-8)和CXCL10

CXCL8基因编码的蛋白CXCL8是一种趋化因子, 属CXC趋化因子家族的成员, 主要参与炎症反应。炎症反应中, CXCL8招募中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞到炎症部位, 发挥抗感染作用。CXCL10是抗菌基因编码的趋化因子, 也属CXC家族成员, 是受体CXCR3的配体。结合受体CXCR3后, 可刺激单核细胞、自然杀伤细胞和T细胞迁移, 调控粘附分子的表达。

NF-κ B 作为炎症反应的重要转导通路, 参与对免疫反应及炎症反应的调控, 包括介导机体对病原体入侵的天然免疫及适应性免疫应答, T、B细胞的发育、增殖及炎症反应等生物过程。NF-κ B 还可调控CXCL8的表达, 在本次研究中, 炎性细胞因子CXCL8表达上调, 说明HEV感染后, NF-κ B通路激活, 促进CXCL8表达上调, 促进机体免疫相关蛋白合成、生长抑制、树突状细胞及NK细胞活化、CTL细胞分化以及抗体产生, 并最终造成感染细胞凋亡。

3.5 EIF2AK2(PKR)

该基因编码的蛋白质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 结合dsRNA后可通过自磷酸化激活, 活化后可以磷酸化翻译起始因子(EIF2S1), 使其活化从而抑制蛋白质的合成, 在病毒感染的固有免疫反应中起着关键作用。EIF2AK2可选择性调节免疫应答基因的转录[21], 也可通过磷酸化EIF2S1的α 亚基, 最终导致细胞和病毒蛋白质的合成停止, 抑制病毒的复制。作为一个衔接蛋白和/或通过其激酶活性, 都可以调节多种信号通路(p38-MAP激酶, NF-kB和胰岛素信号通路)和转录因子(JUN、STAT1、STAT3、IRF1, ATF3), 这些转录因子参与编码促炎性细胞因子和干扰素的基因的表达。

3.6 IRF-9 (ISGF3G)

I型干扰素与细胞表面受体结合后, 通过蛋白激酶作用导致Jak激酶(Tyk2和JAK1)活化, 并使STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化。磷酸化的STATs二聚体化与IRF-9形成一个复合体, 称为ISGF3转录因子, 进入细胞核。ISGF3结合干扰素刺激反应元件(ISRE), 激活干扰素刺激基因的转录, 促进细胞进入抗病毒状态, 发挥抗病毒效应。此外, IRF-9还可抑制细胞内HEV RNA的复制[22]。与此次研究结果类似, 在一项研究中, 急性HEV感染患者的细胞中, IRF-9、STAT1、IFNα 和TNFα 等基因表达增加[23], 这些结果有助于了解HEV感染的潜在炎症过程, 后续研究将关注IRF-9 在抗病毒免疫中的作用。

本研究结合mRNA转录组测序和生物信息学方法, 研究了HEV感染前后HepG2细胞的差异表达基因, 筛选出可能参与抗病毒免疫的基因, 为研究HEV感染提供了目标, 也为进一步研究HEV感染的防御反应机制和理解宿主反应提供新的见解。

利益冲突:

引用本文格式:唐媚娜, 何伟, 肖卫红, 等.基于RNA-seq分析戊型肝炎病毒感染HepG2细胞后的差异表达基因[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(10):813-820. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.092

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