引用本文
施少华, 陈珍, 程龙飞, 傅光华, 傅秋玲, 刘荣昌, 万春和, 陈红梅, 黄瑜. 鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(11): 886-893
SHI Shao-hua, CHEN Zhen, CHENG Long-fei, FU Guang-hua, FU Qiu-ling, LIU Rong-chang, WAN Chun-he, Chen Hong-mei, HUANG Yu. Transcriptomic expression profiles of SPF chicken infected with duck-origin H7N9 subtype avian influenza virus[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(11): 886-893.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.129
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Copyright©2020, 中国人兽共患病学报
中国人兽共患病学报
鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析
施少华1,2,3, 陈珍1,2,3, 程龙飞1,2,3, 傅光华1,2,3, 傅秋玲1,2,3, 刘荣昌1,2,3, 万春和1,2,3, 陈红梅1,2,3, 黄瑜1,2,3
1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州 350013
2.福建省禽病防治重点实验室,福州 350013
3.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州 350013
通讯作者：黄 瑜,Email: huangyu_815@163.com; ORCID: 0000-0003-3654-8898
收稿日期: 2020-04-03
资助项目: 国家重点研发计划项目(No.2017YFD0500802)、国家现代农业技术体系(No.CARS-42)和福建省财政专项(No.FJFS-2017)联合资助
摘要

目的 为了分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡后宿主基因表达水平的变化。方法 以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡,收集肺脏进行高通量测序。结果 与对照组相比,感染组得到差异表达基因740个,其中上调基因有602个,下调基因有138个。GO条目分析发现,差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等。经KEGG 数据库比对注释及富集分析显示有7个通路富集显著,其中Toll-like信号通路有11个基因表达上调,分别为IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4,NOD-like受体信号通路有7个基因表达上调,分别为IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。结论 鸭源H7N9亚型病毒感染SPF鸡后,免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中, TLR4在MD-2的协助下被激活,随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5,继而引起CCL4、IL-6显著表达。同时NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥着重要作用。

关键词: 鸭源; 禽流感病毒; H7N9亚型; 转录组学
中图分类号:S855.3 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)11-0886-08
Transcriptomic expression profiles of SPF chicken infected with duck-origin H7N9 subtype avian influenza virus
SHI Shao-hua1,2,3, CHEN Zhen1,2,3, CHENG Long-fei1,2,3, FU Guang-hua1,2,3, FU Qiu-ling1,2,3, LIU Rong-chang1,2,3, WAN Chun-he1,2,3, Chen Hong-mei1,2,3, HUANG Yu1,2,3
1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013, China
2.Fujian Provincial Key Laboratory for Avian Diseases Control and Prevention, Fuzhou 350013, China
3.Animal Diseases Control Technology Development Center,Fuzhou 350013, China
Corresponding author: Huang Yu, Email:huangyu_815@163.com
Fund:National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFD0500802), Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (No. CARS-42) and Financial Special of Fujian Province (No. FJFS-2017).
Abstract

To investigate the expression changes of host genes of SPF chickens infected with duck-origin H7N9 subtype avian influenza virus. The lungs of SPF chickens infected with duck-origin H7N9 subtype avian influenza virus were collected for high-throughput sequencing. Compared with the control group, 740 genes were differentially expressed in the infection group, including 602 up-regulated genes and 138 down-regulated genes. The analysis of the GO items showed that the differentially expressed genes were mainly involved in immune responses and inflammatory responses. KEGG database comparative annotation and enrichment analysis showed that there were 7 pathways with significant enrichment, among which 11 genes were up-regulated in Toll-like pathway, namely IL-6, TLR4, Pik3, IRF7, MD-2, IRF5, MYD88, CD86, STAT1, TLR2, and CCL4. There were 7 up-regulated genes in NOD-like receptor signaling pathway, which were IRF7, CTSB, P2RX7, CYBB, PSTPIP1, HSP90AA1, and NAMPT. In Toll-like signaling pathway,TLR4 was activated by MD-2 after viral infection, and then activated downstream IRF5. At the same time, the NLRP3 inflamator also played an important role in the process of H7N9 virus infection.

Key words: duck-origin; avian influenza virus; H7N9 subtype; transcriptomics

禽流感(Avian influenza, AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的一种严重危害家禽和人类健康的人兽共患病[1]。其病原AIV属于正黏病毒科A型流感病毒属。依据表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶的抗原关系差异, AIV可分为16种HA亚型和9种NA亚型[1, 2, 3]。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著, 同一亚型病毒不同分离株的毒力也不尽相同。AIV还可通过基因突变、抗原漂移和重组极易产生威胁动物和人类健康的新型流感病毒。

自2013年上海和安徽暴发人感染H7N9亚型禽流感事件以来[2], 人群中已发生5波流行, 共造成1 567人感染、605人死亡, 其死亡率高达40%[3]。然而, 在流行人H7N9亚型禽流感初期, 家禽并不发病, 主要原因是在病毒血凝素裂解位点处缺少连续的碱性氨基酸, 对鸡不致病或呈低致病性[4]。然而, 经过4波流行之后, H7N9亚型AIV第5波流行株的血凝素裂解位点插入了多个碱性氨基酸, 造成对家禽的致病性增强[5, 6, 7, 8]。对活禽市场监测表明, 目前鸡仍是家禽中H7N9亚型禽流感病毒的主要分离宿主, 水禽分离率较低[9]。对于鸭源H7N9亚型禽流感的致病机理仍不清楚。

为此, 本研究以分离自活禽市场的鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡, 评价其对鸡的致病性, 同时通过转录组学分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒对鸡的致病机理, 结果表明SPF鸡感染鸭源H7N9亚型病毒后, 其免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中, TLR4在MD-2的协助下被激活, 随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5, 继而引起CCL4、IL-6的表达。同时, NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥重要作用。

1 材料与方法
1.1 毒株和实验动物

鸭源H7N9亚型禽流感病毒16221株 (H7N9-16221株), 由福建省农业科学院动物生物安全三级实验室(ABSL-3)分离自活禽市场, 病毒滴度为8.5LogEID50/mL; 试验用鸡20只, 2周龄, 购自济南斯帕法斯家禽有限公司, 正常动物房饲养。

1.2 动物致病性试验

参照世界动物卫生组织OIE标准[10], 在ABSL-3生物安全型禽负压隔离器中进行静脉致病指数(Intravenous pathoginicity index, IVPI)测定。当IVPI值大于1.2时, 即判定为高致病性AIV。

取3周龄SPF鸡, 随机分成2组, 即感染组和对照组, 每组10只, 在生物安全型禽负压隔离器中每只感染组鸡经鼻腔接种106EID50 H7N9-16221株, 0.1 mL/只; 对照组接种等体积灭菌PBS, 0.1 mL/只, 观察3 d。收集感染后3 d内死亡鸡或第3 d扑杀鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑和胰, 匀浆后测定每个样品的病毒载量。

1.3 高通量测序用SPF鸡肺脏的采集

取2周龄SPF鸡, 随机分成2组, 即感染组和对照组, 每组3只。以滴鼻的方式接种106EID50/0.1 mL H7N9-16221株, 对照组SPF鸡接种等体积的PBS。于感染后24 h扑杀所有实验鸡, 快速采集每只鸡的肺脏, 储于液氮冻存后送至上海伯豪生物技术有限公司进行高通量测序。

1.4 RNA的抽提与纯化

采用RNAiso Plus Total RNA extraction reagent(Takara)对样品进行总RNA的抽提, 抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后使用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set进行纯化, 经NanoDrop ND2000分光光度计及Agilent Bioanalyzer 2100进行质检备用。

1.5 高通量测序

将纯化后的mRNA片段化, 随后进行第一条cDNA链的合成及第2条cDNA链的合成, 末端补平后在3'末端加A, 经连接接头、富集等步骤后完成测序样本文库的构建, 最后应用Illumina X ten测序。

1.6 测序结果的分析

1.6.1 差异表达基因的筛选 应用edgeR[11]进行样本间差异基因分析, 得出P value后进行多重假设检验校正, 通过控制FDR(false discovery rate)来决定P value的阈值[12, 13], 校正后的P value即Q value。同时, 我们根据FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值计算差异表达倍数, 即Fold-change。差异基因筛选条件如下:Q value< 0.05且Fold-change≥ 2。

1.6.2 差异表达基因的GO和KEGG分析 利用Gene Ontology(简称GO)数据库, 可将基因按照它们参与的生物过程(biological process)、细胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)等对相应的差异基因数目进行统计。计算得到的P value通过多重假设检验校正之后, 以Q value< 0.05为阈值, 满足此条件的GO term定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。与GO富集相同的原理对差异基因进行KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes) pathway富集分析。

1.7 细胞因子的qPCR验证

为了验证病毒感染肺部基因差异表达的测序结果, 选取差异表达的基因进行荧光定量qPCR验证。实验以β -actin基因为管家基因(表1), 目的基因的相对表达水平按2-△ △ CT公式计算[14], △ △ CT=(CT目的基因-CT内参基因)感染组-(CT目的基因-CT内参基因)空白对照组。用SPSS 19.0软件进行生物统计学分析, 通过双侧t检验方法进行分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

表1 检测细胞因子的qPCR引物 Tab.1 Primers for qPCR to detect cytokines
2 结果
2.1 鸭源H7N9病毒对SPF鸡的致病性

通过6周龄SPF鸡测定鸭源H7N9病毒的IVPI, 结果显示H7N9-16221株的IVPI为2.8, 高于高致病性阈值1.2。

以106EID50的H7N9-16221株病毒通过滴鼻方式攻击3周龄SPF鸡, 于接种后第2 d开始发病, 并于第3 d出现死亡, 采集所有实验鸡的组织脏器并进行病毒滴定。结果显示, 实验鸡感染H7N9-16221株在肺、肝等多个组织均有病毒分布, 其中以肺脏病毒滴度最高, 达5.02 Log10EID50(表2)。

表2 鸭源H7N9-16221株病毒在SPF鸡组织脏器的复制 Tab.2 Replication of duck-origin H7N9-16221 virus in SPF chickens
2.2 高通量测序数据质量检测

将纯化后的mRNA片段化以构建测序样本文库, 应用Illumina X ten对所构建的测序样本文库的进行测定, 通过对测序获得的原始碱基和原始序列进行质量过滤, 从感染组3只鸡肺脏样品中分别获得8.67、7.93、7.68 G碱基数, 对照组3只鸡肺脏样品中分别获得7.84、6.83、8.29 G碱基数, 碱基质量大于20(Q20)的比例均> 95%, GEO数据库登录号为GSE151661。感染组3只鸡肺脏样品中获得raw reads分别为57、52、51 M条, 经筛选后获得clean reads分别为55、50、48 M条; 对照组3只鸡肺脏样品中获得raw reads分别为52、55、45 M条, 经筛选后获得clean reads 49、52、43 M条。

2.3 转录组差异表达

基因筛选与对照组相比, 感染组得到差异表达基因740个, 其中上调基因有602个, 下调基因有138个。对差异表达基因进行可视化分析, 其中-Log10(FDR)> 1差异表达基因(图1)。

图1 差异基因Heatmap图Fig.1 Heatmap of differentially expressed genes

比对参考基因组数据库, 与对照组相比, 所获得的感染组前10位上调基因分别为:IRG1、RSAD2、CCL19、STAT1、OLFML1、CMTR1、C1S、MDA5、OASL和MPEG1; 前10位下调基因分别为:PRSS35、otokeratin、FBN2、COL10A1、NYAP2、DBN1、NELL1、CPXM1、CAPSL和SCARA3(表3)。

表3 感染后24 h Top10差异表达基因 Tab.3 Top10 differentially expressed genes at 24 h after infection
2.4 转录组GO数据库注释及显著性富集分析

对差异基因进行GO功能注释, 病毒感染后有204个显著富集的GO条目, 其中有186个GO条目涉及生物学过程, 有7个GO条目涉及细胞成分, 有10个GO 条目涉及分子功能。在涉及生物学过程的差异基因GO条目绝大部分与免疫应答有关, 如免疫反应、免疫系统过程, 天然免疫反应、免疫反应调节等; 在涉及分子功能的差异基因GO条目与炎症反应有关, 如趋化因子活性、趋化因子受体结合、细胞因子活性、细胞因子受体结合等(表4、图2)。

表4 感染后24 h Top10差异表达GO富集 Tab.4 Top10 differental expression enrichment of GO at 24 h after infection

图2 Top30 GO富集Fig.2 Top30 GO enrichment

2.5 转录组KEGG数据库注释及显著性富集分析

将差异表达基因在KEGG数据库中进行比对注释及富集分析, 有7个通路得以显著富集, 如 Toll-like信号通路、NOD-like信号通路和凋亡等, 与对照组相比Toll-like 受体信号通路有11个基因的表达上调, 分别是IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4。NOD-like受体信号通路有7个基因的表达上调, 分别是IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。凋亡信号通路有10个基因的表达上调, 分别是PIK3、CTSB、CTSC、TNFSF6、PRF1、PMAIP1、GADD45G、CASP7、APAF1和CTSS, 1个基因下调, 为CAPN2(表5)。

表5 感染后24 h KEGG差异富集通路 Tab.5 KEGG differential enrichment pathway at 24 h after infection
2.6 差异表达基因的qRT-PCR验证

为了验证从转录组测序数据中获得差异基因结果的可靠性, 我们对IL-6、STAT1、OASL、MDA5、MPPEG1、OLFML1、COL10A1等基因进行qRT-PCR检测, 比较分析qRT-PCR检测与高通量测序数据, 二者基本一致, 表明转录组测序数据的可靠性(图3)。

图3 定量RT-PCR与高通量测序结果的比较Fig.3 Comparison of quantitative RT-PCR and high throughout sequencing

3 讨论

2013年3月, 位于我国华东地区的上海市和安徽省两地相继报道了H7N9亚型禽流感病毒感染人病例, 引起全世界高度关注和恐慌。在2013年3月至2016年9月, 共发生4波流行, 造成798人感染, 病死率达40.6%[3]。其元凶H7N9亚型禽流感病毒是鸭源H7N3亚型、鸡源H10N9亚型和禽源H9N2亚型的三元重配病毒[18, 19], 其血凝素裂解位点处缺少连续的碱性氨基酸, 对鸡不致病或呈低致病性[20], 因此家禽仅为人H7N9病毒的基因供体, 感染后不表现临床症状或症状比较温和。然而, 在第5次流行高峰期间, 首次在人感染H7N9病例中分离到具有强毒裂解位点的毒株(TW1)[3, 21, 22], 提示对鸡呈高致病性。目前鸭感染H7N9亚型禽流感病例较少。因此有必要对鸭源H7N9亚型禽流感病毒进行研究。本研究以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡, 其IVPI为2.8, 为强毒株, 通过对病毒感染的组织分布进行分析发现, 病毒主要以肺部感染为主。因此, 本研究选择肺脏作为鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组分析的研究对象。

在转录组的高通量测序技术中, RNA-seq具有通量高、可重复性好、检测范围宽、定量准确等特点, 已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原感染动物的转录组研究。转录组学研究中测序获得的Clean Read数量和质量及mapped到参考基因组的比对率对后续数据分析有重要的影响, 本研究利用RNA-seq高通量测序技术对H7N9亚型AIV感染SPF鸡的肺脏转录组研究发现, 从感染组和对照组鸡肺脏样品中均可获得大于6 G碱基数, 碱基质量大于20(Q20)的比例均> 95%。每个样品大于50 M条的raw reads, 经筛选后获得clean reads 40 M条, 结果符合预期质量要求, 表明本研究所获得的测序数据可用于后续分析。

本研究从感染组得到差异表达基因740个, 其中上调基因有602个, 下调基因有138个, 表明流感病毒感染后机体细胞发生剧烈的细胞反应, 提示我们分离的鸭源H7N9亚型禽流感病毒有可能像其它高致病性禽流感病毒一样产生过激的细胞反应, 引起“ 细胞因子风暴” [23, 24, 25]。为了确定差异表达基因涉及的信号通路, 我们通过GO和KEGG数据库进行富集分析。对差异基因进行GO功能注释, 病毒感染后有204个显著富集的GO条目, 其中富集差异最为显著的10个GO均涉及生物过程, 差异基因GO条目绝大部分与免疫应答, 如I型干扰素生物合成过程、IFN-β 反应、Th1免疫反应等。KEGG分析发现, SPF鸡感染H7N9亚型禽流感病毒后出现免疫相关的信号通路富集。

天然免疫系统是机体的第一道防线, 是宿主抵御病原体侵害的一个高度保守的细胞信号机制[26]。宿主细胞通过一种可识别病原相关的分子模式(PAMP)的模式识别受体(PRR)来检测感染性病毒的存在, 从而启动诱导促炎细胞因子和干扰素信号的级联反应, 最终发挥抗病毒作用[26, 27]。目前已鉴定出3类病毒感染的PRR:RIG-I样受体(RLR), Toll样受体(TLR)和NOD-样受体(NLR)[28]。在流感致病过程中, TLR可导致I型IFN和促炎细胞因子(IL-6、IL-12)、趋化因子(CCL4)和共刺激因子(CD86)的表达, 从而限制病毒复制和传播, 诱导组织发生炎症反应, 激发机体产生先天性和获得性免疫反应。本研究发现, TLR4信号通路的相关因子显著富集。从信号通路可推断, 病毒感染后, 在MD-2的协助下, TLR4被激活, 随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5, 继而引起CCL4、IL-6的表达。

NOD样受体(NLR)是固有免疫系统中的一种模式识别受体。当识别危险信号后, NLR家族成员与PYHIN(pyrin and HIN domain)家族成员组成的胞浆多蛋白复合物(炎症小体), 被多种病原相关分子模式或损伤相关分子模式激活后引起级联反应。目前已发现多种炎症小体, 如NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2炎症小体。其中, NLRP3炎症小体在流感病毒感染中扮演着重要的角色。在没有内外源刺激因素作用的情况下, NLRP3的LRR结构域通过与泛素连接酶相关蛋白SGT-1和热休克蛋白HSP90结合, 处于自我抑制状态[29]。NLRP3被激活后, 其PYD区域与ASC的PYD区域结构相结合, 招募Caspase-1前体, 装配成NLRP3炎症小体, 介导Caspase-1的活化、促炎症因子IL-1β 、IL-18和IL-22的成熟与分泌[30]。本研究中, CTSB、PSTPIP1、HSP90AA1的基因表达均显著上调, 同样也说明了H7N9亚型病毒也可通过NLRP3炎症体发挥作用[31]。

综上, 通过试验结果可推测, 鸭源H7N9病毒感染SPF鸡后, 诱导强烈的天然免疫, 病毒感染后, 在MD-2的协助下, TLR4信号通路被激活, 随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5, 继而引起CCL4、IL-6的表达; 同时, NLP3炎症体在抗病毒过程中发挥着重要作用。但其机制仍需要进一步开展实验研究加以证明。

利益冲突:无

引用本文格式:施少华, 陈珍, 程龙飞, 等.鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(11):886-893. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.129

编辑:张智芳

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