引用本文
周崇兴, 林定文. 基于组学检测的结核病发病风险研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(11): 934-939
ZHOU Chong-xing, LIN Ding-wen. Research progress on determining tuberculosis risk through on omics detection[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(11): 934-939.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.153
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Copyright©2020, 中国人兽共患病学报
中国人兽共患病学报
基于组学检测的结核病发病风险研究进展
周崇兴, 林定文
广西壮族自治区疾病预防控制中心, 南宁 530028
通讯作者：林定文, Email: drldw@163.com; ORCID: 0000-0002-3609-3451
收稿日期: 2020-04-30
资助项目: 国家自然科学基金项目(No.81760603)
摘要

结核病严重威胁着人类健康,防控形势严峻,研究其发病风险的检测有助于结核病的防治。我国结核感染人数众多,绝大多数患者为潜伏结核感染(Latent Tuberculosis Infection,LTBI),是内源性发病的库源,5%~10%的潜伏感染者会在一生中发生结核病。对LTBI患者进行风险性预测和干预治疗,防止其发展为活动性结核病在结核病防治中具有重要作用。目前尚无诊断LTBI的金标准,也没有权威发布用于预测感染后发病风险的生物学预警指标。本文从转录组学、蛋白组学和免疫组学3方面对LTBI进展到活性结核病的研究进展进行综述,并对结核病发病风险的检测研究方向进行了展望。

关键词: 结核病; 发病风险; 转录组学; 蛋白质组学; 免疫组学
中图分类号:R378.91 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)11-0934-06
Research progress on determining tuberculosis risk through on omics detection
ZHOU Chong-xing, LIN Ding-wen
Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention,Nanning 530028,China
Corresponding author:Lin Ding-wen, Email: drldw@163.com
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81760603)
Abstract

Tuberculosis is a serious threat to human health, and its prevention and control are critical. Research on detecting tuberculosis risk can aid in its prevention. Tuberculosis infections are highly prevalent in China, and most patients have latent tuberculosis infections (LTBI), which are the source of endogenous disease. Approximately 5%-10% of people with LTBI develop tuberculosis in their lifetime. Tuberculosis risk prediction and drug intervention aid in preventing the development of LTBI into active tuberculosis and play an important role in tuberculosis control. Currently, no gold standard exists for LTBI diagnosis, nor is there an authority publishing biological warning indicators for predicting the risk of progression of LTBI to active tuberculosis. This article reviews the research progress on the development of active tuberculosis from LTBI according to three aspects: transcriptomics, proteomics, and immunomics. In addition, potential research directions for tuberculosis risk detection are described.

Key words: tuberculosis; risk; transcriptomics; proteomics; immunoomics

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)引起的感染性疾病, 严重危害人类健康[1]。全球估计有17亿人感染了结核分枝杆菌, 因此面临罹患该病的危险[2]。在感染结核分枝杆菌之后, 5%的感染者可发展为原发性结核病, 若同时伴有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染, 这种概率可高达10%, 而近90%的感染者可无症状长期携带结核分枝杆菌成为潜伏结核感染者(Latent Tuberculosis Infection, LTBI)[3]。中国是全球结核病潜伏感染负担最重的国家之一[4], 结核病防制形势严峻[5]。近年, 基于统计模型的预测, 中国估计有3.6亿人感染结核分枝杆菌[6]。高磊等[7]在中国开展的目前全球最大规模的结核分枝杆菌感染的流行病学调查和队列研究表明, IGRA阳性率为19%(不同地区为7%~25%)。相对于结核潜伏感染者, 现症的结核病人只是冰山一角。在短期内疫苗研发难以实现突破的前提下, 消除结核病, 除了目前的提高患者发现, 控制传染源外, 积极开展结核潜伏感染高危人群的预防性治疗是实现发病率快速下降的有效途径。研究证实, 成功的预防性化疗可以有效的减少结核潜伏感染人群发病, 保护效果可以达到60%~90%[8], 是直接降低发病率的重要手段。如不对LTBI进行治疗, 2年内发展到活动性结核病(Active Tuberculosis, ATB)的机会为5%, 还有5%~10%可在感染2年后任何时间发病[9]。而抗结核药物有较大副作用, 对潜伏感染者实施全程药物干预的治疗依从性一直处于较低水平[10, 11, 12], 对所有LTBI患者进行治疗干预还不太现实。因此, 从众多结核潜伏感染者中快速准确的筛查出可能发病的检测标志物, 对结核病防治工作具有重要现实意义。本文从转录组学、蛋白组学和免疫组学三方面对LTBI进展到ATB的研究进展作一综述。

1 转录组学研究

转录组学是从RNA水平研究基因表达情况, 主要是通过检测筛选出与疾病相关的特异性差异性基因表达, 从而发现可用于疾病诊断或风险预测的生物标志物。近年来, 随着高通量测序技术的发展, 将测序应用于结核感染人群相关标志物的研究越来越多, 全血中检测基因转录组的研究方法成为热点。一些研究小组结合转录组学的方法探索LTBI到ATB的进展, 成功发现不少LTBI进展到ATB的生物标志物。Berry等[13]通过系统深入的研究, 报道了一种86基因的TB标志物检测组合, 它主要是中性粒细胞驱动的1型干扰素, 通过监测血液中干扰素诱导的相关基因表达来评定活动性肺结核患者的治疗效果, 发现LTBI和ATB的差异基因表达, 同时验证其可靠性。Kaforou等[14]对TB、LTBI和其他疾病患者的血液转录生物标志进行了研究, 并在一项病例对照研究中鉴定出44个转录本标志物, 其敏感性为100%, 特异性为96%。Costa等[15]则发现GZMA、GBP5和FCGR1A (CD64)基因的表达谱能够将TB与非肺结核病肺炎及哮喘区分开来, 敏感性为93%, 特异性为95%。Bloom等[16]发现144份标本转录标志物能将结核与结节病、肺炎、肺癌和健康对照组患者区分开来, 其敏感性超过80%, 特异性超过90%。Sutherland[17]的研究在比较了4个不同非洲国家的患者后发现, CD64是诊断患者是否感染结核杆菌的一个有用标志物, 它与艾滋病毒感染和研究地点无关。Anderson等[18]评估了来自南非, 肯尼亚和马拉维的疑似结核病儿童的mRNA转录特征, 并将其与潜伏性结核病感染和其他疾病儿童的概况进行了比较, 验证诊断为结核病阳性的51份转录本, 灵敏度为82.9%, 特异性为83.6%。Zak DE等[19]前瞻性观察研究南非6 363例12~18岁LTBI青春期队列, 每6个月采血监测比较结核病的进展, 通过对46例进展为ATB和匹配对照107列仍然是LTBI的全血RNA进行测序, 鉴定了发展为ATB病人的16个基因标志物, 用于预测从LTBI发展为ATB的敏感性为66.1%, 特异性为80.6%; 研究者又用独立的2个队列进行验证, 随访2年, 分别有43例及30例进展为ATB, 通过实时荧光定量PCR验证转录组的16个基因表达, 12个月时该16个基因的表达谱用于预测LTBI进展到ATB的灵敏度为53.7%, 特异度82.8%[19]。Sweeney 等[20]发现3个基因(GBP5, DUSP3和KLF2)组合用于活动性结核的诊断, 然后在11个数据库验证该组合在诊断结核病的效能, 结果发现该基因组合在鉴别诊断结核患者和健康对照或潜伏感染的效果较好, AUC分别为0.9 (敏感性85%, 特异性93%)和0.88(敏感性80%, 特异性86%)。Sara Suliman等[21]人发现, 不同地区如南非和冈比亚血液转录组基因表达具有地域特异性结核病进展标志物, 进而研究适用于部分非洲地区四基因(RISK4:GAS6、SEPT4、CD1C、BLK)表达谱可以预测结核病高风险人群患病的方法, 此法在南非、冈比亚和埃塞尔比亚三个非洲国家验证, 结果显示队列中结核病进展的风险预测较好。随后作者将RISK4基因表达与Sweeney 等[20]发表的转录标志物DIAG3(3基因诊断标志物)、Maertzdorf等[22]发表的转录组标志物DIAG4(4基因诊断标志物, 敏感性为88%, 特异性为75%)和之前发表的16个基因标志物[19]进行比较, 这些标志物的准确性接近, 差异没有统计学意义, 但DIAG3、DIAG4和发表的16个基因标志物在预测性能上表现出了队列的差异性, 且未在不同地区不同人群验证, 这表明RISK4是一个更大众化更全面的预测标志物。LV L等[23]报道了ATB与LTBI患者血清中外泌体的RNA系列, 鉴定出20个顶端差异性表达基因(DEGS)可提供ATB和LTBI的鉴别, 建立了LTBI和ATB高表达的DEGS 6个表达类型。陈献雄等[24]在验证所筛选的基因转录组发现HBB和TNFRSF10C-在结核患者比对照组表达高, 而且经抗结核治疗后有显著下降, 其中HBB基因在诊断健康对照和结核患者, AUC为0.98, 敏感性为100%, 特异性为95%; 在诊断潜伏感染和结核患者, AUC为0.985, 敏感性为100%, 特异性为95%.TNFRSF10C基因在诊断健康对照和结核患者, AUC为1.00, 敏感性为100%, 特异性为100%; 在诊断潜伏感染和结核患者, AUC为0.9775, 敏感性为95%, 特异性为100%。Jennifer R等[25]在英国一项队列研究中发现新型三基因转录信号(BATF2、GBP5、SCARF1)用于预测LTBI发展为ATB的效果, 333个HIV阴性结核病患者新队列中, 平均随访346 d阳性预测值(PPV)为50%(95%置信区间:15.7%~84.3%), 阴性预测值(NPV)为99.3%(97.5%~99.9%)。这些研究从转录组学的角度阐述了LTBI发展为ATB的变化过程, 也筛选出部分差异表达的基因标记物, 这些标记物敏感性和特异性各异, 在不同人群和不同地区准确性不同, 表明用于预测LTBI发展为ATB的基因标记物存在人群和地域的差异性。这些结果为将来标记物的进一步研究和临床应用提供了科学依据。

2 蛋白组学研究

蛋白组学是针对生物所能表达的所有蛋白质, 是寻找疾病分子标记物有效的方法之一。结核分枝杆菌在进入机体潜伏感染并转化成为ATB的过程中, 会引发机体内各种细胞因子及相关蛋白发生一系列的动态变化, 这些变化的检测就为预测LTBI转化成为ATB的诊断提供了可能。而且蛋白组学可检测样本类型多样, 有血浆、血清、尿液、单细胞、外泌体[26]等, 有利于样本点采集和普及。有研究发现在血清中LTBI相较于正常人白介素-2、单核趋化蛋白2、干扰素诱导蛋白-10、干扰素-10、肿瘤坏死因子超家族成员14、颗粒酶B等蛋白出现显著性差异[27]。Young BL等[28]发现在尿液当中有10种分枝杆菌蛋白仅在明确的结核病患者的尿液中发现, 而有6种分枝杆菌蛋白仅在假定的LTBI患者的尿液中发现。Xu等[29]先对活动性肺结核患者和健康人的血清进行iTRAQ技术耦合双向液相色谱与串联质谱技术分析, 筛选出100个差异蛋白, 对其中载脂蛋白C Ⅱ 、类CD5抗原、透明质酸结合蛋白2、视黄醇结合蛋白4、血清淀粉样蛋白A4和血浆酶原结合蛋白进行Western Blot及Elisa方法验证。ATB和LTBI外泌体结核分枝杆菌多肽也已经被证实能检测出20种[30]。ATB相较于LTBI和正常对照组的粗血浆总蛋白表达谱在11 kDa和在5 kDa区域出现明显的上调[31]。Sigal等[32]发现SAA1, PCT, IL-1l, IL- 6、CRP, PTX-3, MMP-8共7个蛋白与结核病的疾病进程有密切关系。SunH等[33]检测出LTBI和ATB的31个差异显著蛋白, Western Blot检测其中8个蛋白的结果与之100%一致, 有6个能够被ELISA检验出显著性差异。Li C等[34]的研究发现:健康对照组和肺结核病人组的蛋白表达相比, 肺结核病人血清中有26种蛋白表达水平发生显著的变化。国内有研究表明Rv0494蛋白可能下调了结核杆菌的生理活性相关基因的表达, 从而减缓了结核杆菌在压力环境下的生长速率[35], 感染者以潜伏状态存在。Yoon等[36]报道的一项即时临床C反应蛋白(CRP)试验, 用于筛查HIV感染者中的结核病人, 诊断结果经培养证实的结核病, 敏感性为89%, 特异性为72%。CRP与其他六种蛋白质结合可在疑似患有肺结核的个体中诊断出肺结核, 在5个非洲国家研究结果敏感性为93.8%, 特异性为73.3%。De Groote等[37]通过SOMAscan(定量生物标志物检测)技术发现了6种蛋白质生物特征可作为结核病的筛查工具, 在来自各种结核病流行地区的700多个样本测试中, 其敏感性为90%, 特异性为80%。Chegou NN等[38]在非洲5个国家的流行病学研究, 从716名参与者的血清中检测到7种宿主血清蛋白生物标志物, 可在不同地区用于诊断结核病, 不受是否感染HIV影响, 敏感性为93.8%, 特异性为73.3%, 阳性和阴性预测值分别为60.6%和96.4%。这些研究为诊断区分LTBI和ATB提供了一定的理论基础。

3 免疫组学研究

免疫组学是利用组学技术研究免疫系统的全套分子库及作用的靶分子等。结核杆菌感染后, 会诱发机体产生一些列复杂的免疫应答, T 细胞介导的细胞免疫应答在其感染及发病过程中发挥关键作用, T细胞亚群比例及相关细胞因子是决定细胞免疫强弱的主要因素, 了解其致病机制和宿主免疫反应之间的相互作用, 有助于找到感染各阶段合适的免疫学标记物。目前公认的 LTBI 的诊断需依靠结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)及γ -干扰素释放试验(interferon-γ release assay, IGRA), 通过体内、体外及离体检测特异性抗原刺激后记忆T细胞的免疫应答, 但尚无证据表明TST及IGRA可鉴定结核病从感染到发病的不同阶段和发展趋势, 不能鉴别LTBI和ATB, 因此TST和IGRA是当前可接受但不完善的诊断方法。Diel R等报道TST和IGRA在感染清除后检测仍可阳性, 预测LTBI到ATB进展能力较差, 阳性预测值分别为1.5%和2.7%[39]。有研究发现活动性结核病患者体内分泌TNF的特异性 CD4+T细胞有助于区分活动性结核病和潜伏结核感染[40]。部分趋化因子及细胞因子已经被证实和结核病先天性免疫应答相关[41]。KEGG pathway分析结果则提示细胞因子在结核发病起了重要的作用[42]。La Manna MP等[43]研究发现外周血中单核细胞与淋巴细胞的比率是评价感染条件下免疫反应效能的重要指标, 其比值增加可能与活动性结核的严重程度有关, 可用于预测ATB的风险。Barcellini L等[44]评估增加刺激 CD4+和 CD8+T细胞新抗原TB2的QFT-Plus检测(新型干扰素释放实验QuantiFERON-TB Gold Plus), QFT-GIT(γ -干扰素释放试验, QuantiFERON-TB gold In-Tube)与QFT-Plus总符合率为80%, CD8+应答与结核杆菌暴露量增加有关, 提示可鉴定近期感染。Rozot V等[45]发现LTBI和ATB中, 特异 CD8+T细胞(主要为效应性记忆细胞)功能和表型不同, 分别占15%和60%。Ruhwald M等[46]在979例C-TB皮试安全性研究中, 皮试结果与QFT的结果符合率为94%(785/834), 硬结≥ 5 mm时, ATB阳性率为67%。Petruccioli E等[47]研究检测6种细胞因子区分LTBI和ATB, 发现Ag85A-Ab和IFNγ 特异性T细胞增高与ATB风险降低有关, CD27-IFNγ + CD4+T细胞可能是结核病预测的标志物。杨永林等[48]评价γ 干扰素诱导蛋白10(IP-10)可能是鉴别 ATB和LTBI的有效工具, 鉴别ATB和LTBI的敏感度为80% , 特异度为90%。而KEGG pathway分析结果则提示细胞因子在结核发病过程中起了重要的作用[49], IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17, IFN-γ , TNF-α 等细胞因子和结核密切关系已获得证实[50]。Sen W等[51]分析确定了经结核抗原刺激的IFN-γ , IP-10和IL-1Ra的六细胞因子生物特征, 以及未经刺激的IP-10, VEGF和IL-12(p70)的生物特征, 并进一步评估, 结果显示灵敏度为85.7%, 特异性为91.3%, 总准确度为88.7%, 可以准确区分ATB和LTBI, 这种方法有望用于ATB的早期快速诊断检测。LTBI宿主体内的免疫系统能够控制结核杆菌的活跃复制而不发展为结核病, 但在免疫力低下时, 结核杆菌能够重新复制而发展为结核病人并出现相应的临床症状。对LTBI宿主和结核患者体内细胞免疫反应差异深入的分析, 将为区分ATB和LTBI提供可能的标志物, 如研究较多的细胞因子、特异性T细胞等, 均表现出了免疫反应的差异性。

4 LTBI进展到ATB研究展望

综上所述, 在研究LTBI进展到ATB的生物学标志物中, 免疫组学和蛋白组学的研究较多, 主要是分析组学中各种标志物的差异, 但真正用于诊断区分LTBI和ATB的报道较少。免疫组学主要分析出IP-10等[52]细胞因子的生物特征, 可以区分LTBI和ATB, 但没有得到进一步验证和推广。蛋白质组学研究仍停留在一个基础的水平, 没有深入探讨差异蛋白在结核病发病机制中的作用, 检测出一些差异蛋白但标本量较少, 缺乏评估和验证。转录组学的研究最多, 也获得了比较重要的标志物, 很多标志物很有希望应用于临床(准确性> 80%), 部分标志物也通过RT-qPCR方法进行验证[20, 21, 22], 局限性在于研究在多个地点进行, 只采用了回顾性病例对照研究, 均使用了案例控制设计, 处于第二阶段的诊断研究, 灵敏度和特异度仍有待提高。

现有的研究和进展有一定的局限性, 但也为今后更多更加深入的生物标志物研究提供了方向和理论基础。结核杆菌致病机制与宿主免疫反应之间的相互作用关系较为复杂, 更好地理解潜伏性结核感染的发病机制是未来重要的研究内容, 这些研究有助于发现免疫生物标志物, 进而提升发病预测能力。一些免疫因子的变化情况与机体自身免疫状况乃至地域性差异有一定联系, 针对多种免疫因子的复合诊断方法或许成为今后研究的方向。蛋白质组学中结核杆菌对人体宿主的致病机制取决于蛋白质或蛋白质-核酸的相互作用, 了解差异蛋白质在结核病病程中的变化, 有助于探讨机体的病理变化和活动性结核病的发病机制, 多种目标蛋白标志物组合建立诊断方法已成为发展趋势。转录组学是基于结核杆菌感染后引起机体的基因表达发生一系列变化, 上调或下降, 高通量测序技术可以准确的分析基因表达差异, 为结核病特异性发病机制提供潜在思路。现有研究发现的差异基因比较多, 不同国家不同地区的标志物在性能上表现出了队列差异, 联合筛选出适合本地区的基因标志物, 采用前瞻性、大样本量的研究方法, 并通过整合分析和分子生物学验证其可靠性, 建立LTBI发展为ATB的诊断模型是转录组学的研究方向。

5 结语

世界卫生组织提出的2035年终止全球结核病的流行总目标, 我国在结核病防制中还面临着诸多挑战, 而筛选出比较明确的生物学标志物用于预测LTBI转化成为ATB, 将能从源头精准进行预防性服药, 大幅抑制结核病的发展, 也将是践行“ 预防为主” , 向终止结核病的流行总目标迈出重要一步。阻断LTBI发展为ATB是结核病防制努力的方向, 我们期待能尽早的研究发现鉴定LTBI发展为ATB的生物学标志物, 并应用于实际的结核病防制工作中。目前结核病发病风险预测的研究还处在初级阶段, 转录组学领域有一定的成果, 别的几个领域暂时没有显著的成果报道。而如何提高发病风险生物学标记物的灵敏度和特异度, 是今后研究需要改善的地方。

鉴于不同人群不同地区, 生物学标志物可能不一样, 单一的组学或技术有其局限性。可以考虑多个组学组合的方式进行研究, 组学与其他学科交叉应用, 多种技术方法整合互补, 通过海量数据的统计学和相关性分析, 筛选和验证最适合本地区的生物学预警标记物, 并且将检测方法优化, 寻找出一种更为简便、易于操作和经济的实验方法, 从而在临床应用中推广和普及。

利益冲突:无

引用本文格式:周崇兴, 林定文. 基于组学检测的结核病发病风险研究进展[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(11):934-939. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.153

编辑:张智芳

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