同大多数PE_PGRS家族成员缺乏典型分泌信号的特征一样, PE_PGRS33也无蛋白信号肽, 然而在细胞质中合成的蛋白, 最终却表达于细胞壁表面, 说明结核分枝杆菌能另辟蹊径将胞内合成的PE_PGRS33蛋白转运至细胞表面。研究发现^{[9, 10]}, 与PE_PGRS蛋白分泌有关的是近年来新发现的一种新型分泌系统-Ⅶ 型分泌系统(type VII secretion systems, T7SS), 也被称为ESX系统, 在结核分枝杆菌中存在5种ESX, 分别命名为ESX-1~ESX-5, 参与胞内PE_PGRS蛋白分泌的主要是在进化上出现较晚的ESX-5, 推测PE_PGRS蛋白可能是ESX-5的特异底物。将携带PE_PGRS33基因的质粒分别导入海分枝杆菌野生株E11和ESX-5突变株7CI中, 结果发现ESX-5缺失的突变株不能将蛋白转运至细胞表面, 从而证实PE_PGRS33也是ESX-5的特异底物^[7]。但与结核分枝杆菌不同的是海分枝杆菌转运到胞壁的PE_PGRS33蛋白分子量明显降低, 推测在海分枝杆菌转运的过程中蛋白可能经过加工处理。Burggraaf等^[11]研究海分枝杆菌质粒表达PE_PGRS蛋白的分泌中发现, C端具有天冬氨酸蛋白酶活性的PE_PGRS蛋白(如PE_PGRS35), 包含典型的DTG/DSG序列, 在运送过程中先被加工裂解, 然后再表达在细胞表面。由于海分枝杆菌不天然表达PE_PGRS33蛋白, 可能在菌体内的运输处理过程与结核分枝杆菌存在差异。

完整表达的PE_PGRS33蛋白定位于结核分枝杆菌的细胞壁, PE区起锚定作用嵌埋在胞壁外膜上, PGRS结构域暴露于细胞表面, 负责与宿主细胞相互作用, 未发现分泌至胞外可溶形式存在的蛋白。只有PE结构域而无PGRS结构域的蛋白能在细胞壁上检测到但不能暴露于细胞外, 反之只有PGRS结构域则只能在细胞质中检测到, 进一步证实了PE结构域负责将胞质内合成的PE_PGRS33蛋白转位至细胞壁的功能^[7]。侵入巨噬细胞内的结核分枝杆菌表达的PE_PGRS33蛋白可能经过MHC-Ⅰ 类和Ⅱ 类途径经过抗原提呈以MHC-肽段的形式表达于感染细胞表面, 被T淋巴细胞和B淋巴细胞识别, 在特异性细胞免疫和体液免疫中发挥作用^[12]。

重组耻垢分枝杆菌表达不同长度PE_PGRS33蛋白的结果显示, PE结构域全部缺失菌株只能在胞质中检测到不完整PE_PGRS33蛋白, 表达全长蛋白的菌株可在胞质和胞壁上同时检测到PE_PGRS33蛋白, 在细菌培养上清液中均检测不到PE_PGRS33蛋白, 说明PE_PGRS33不是分泌型蛋白, 属于细胞壁上的结合蛋白, 蛋白的转运信号存在于PE结构域。进一步研究发现, 缺失PE结构域最初30个氨基酸的菌株, 蛋白同样定位于胞质中, 在胞壁上仅有极少量蛋白表达, 提示转位信号存在于蛋白最前端的30个氨基酸中, 下游氨基酸维持结构的稳定性^[7]。目前尚未获得PE_PGRS33蛋白PE结构域的确切构象, 研究最为清楚的PE结构域来源于该家族的独特成员PE25(仅有PE结构域, 与其后的PPE41形成异源二聚体), 考虑到PE结构域的高度保守性, 推测PE_PGRS33蛋白应该具有相似的结构特点。PE25的PE结构域有两个α -螺旋, 分别位于8~37位氨基酸和45~84位氨基酸之间, 由38~44之间一段成环状的氨基酸连接^[13]。结合PE_PGRS33蛋白缺失N端最初30个氨基酸不能转位到细胞壁上的事实, 推测第1个α -螺旋直接参与将蛋白输送至ESX-5分泌系统并最终将其锚定在细胞壁上, 第2个α -螺旋和环状连接区维持完整蛋白的构象稳定性。

在天然表达PE_PGRS33蛋白的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine, BCG)和结核分枝杆菌的研究中同样发现, 缺失PE结构域的菌株蛋白主要存在于胞质中, 但表达完整PE_PGRS33的结核分枝杆菌, 只能在胞壁上检测到蛋白, 不同于耻垢分枝杆菌, 说明在野生型菌株胞质中合成的蛋白全部转位至细胞壁, 不会在胞质中积聚。据此推测, 在结核分枝杆菌复合群可能存在PE_PGRS33蛋白合成的负反馈调节机制, 不会合成过量的PE_PGRS33蛋白使其积聚, 这也可能是细菌在不同生长环境和生长阶段差异性表达该蛋白的原因之一。

非致病的耻垢分枝杆菌重组表达PE_PGRS33后表现出结核分枝杆菌的典型毒力特征, 能侵入巨噬细胞, 在巨噬细胞和宿主组织中的存活能力明显增强。Rv1818c基因发生转座子Tn5367插入突变的菌株, 在液体培养基失去聚集生长的能力呈分散生长, 侵入巨噬细胞和胞内存活能力下降, 回补完整Rv1818c基因后回复野生型的毒力特征。PE_PGRS33基因缺失株(Mtb-Δ 33)和只表达PE结构域的菌株, 进入巨噬细胞的能力显著下降, 主要存在于细胞外, 但侵入上皮细胞的能力不受影响^[18]。进一步研究发现, TLR-2缺失小鼠用表达PE_PGRS33的耻垢分枝杆菌感染后, 细菌亦不能进入巨噬细胞, 肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factors α , TNF-α )的释放水平极低, 由此说明暴露于结核分枝杆菌表面的PE_PGRS33蛋白主要借助PGRS结构域与巨噬细胞表面的TLR-2特异结合^{[20, 21]}。推测PE_PGRS33介导细菌侵入巨噬细胞可能的机制有两个:一是PE_PGRS33蛋白可能类似于病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMP), 能被巨噬细胞的模式识别受体(patern recognition receptor, PRR)TLR识别, 促进内化; 二是结核分枝杆菌表面成分复杂, 有脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖及其他非蛋白成分, PE_PGRS33蛋白与这些表面成分相互作用, 形成适合细菌黏附的空间构象, 增强结核分枝杆菌的黏附能力, 促进细菌侵入。另外, TLR-2介导的细菌内吞与Ca²⁺浓度亦密切相关, PE_PGRS家族普遍存在钙结合基序蛋白, 与Ca²⁺高亲和, 当Ca²⁺浓度耗尽时, PE_PGRS与TLR-2亲和力显著降低^{[22, 23]}。

细胞死亡的形式有3种:凋亡、自噬和坏死。PE_PGRS家族不同成员诱导细胞死亡的方式不同, 同一种死亡方式诱导途径亦不相同^[24]。PE_PGRS33诱导的细胞死亡以凋亡为主, 主要途径是TLR-2依赖的刺激TNF-α 释放。至于能否诱导细胞坏死目前尚存分歧, 有待深入研究。

可溶性的纯化PE_PGRS33和表达于细胞壁表面的PE_PGRS33可同样诱导巨噬细胞凋亡。刺激TNF-α 分泌是PE_PGRS33诱导细胞凋亡的关键, 如事先用TNF-α 抗体处理细胞, 则细胞不发生凋亡。PE_PGRS33介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞和刺激细胞释放TNF-α 的能力均依赖TLR-2^[21]。PGRS结构域与TLR-2特异结合, 在转录水平调节TNF-α 基因表达, 刺激TNF-α 分泌, 同时诱导细胞表达肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1), TNF-α 与TNFR1结合触发死亡信号级联反应。删除PGRS结构域后, 不能刺激TNF-α 释放。通过构建PGRS结构域不同基因片段缺失变异体回补Mtb-Δ 33发现, 介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞的关键序列位于N端140~260个氨基酸之间, 该片段的许多疏水区存在短的亲水片段插入, 可能是TLR-2的结合位点^[21]。诱导TNF-α 释放的信号通路为TLR-2依赖的凋亡信号调节激酶1(apotosis signal-regulating kinase 1, ASK1)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路。TLR-2与PE_PGRS33的PGRS结构域结合后, 激活下游MAP3K家族的ASK1, 活化的ASK1继而激活MAPK家族的p38蛋白和c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK), 通过一系列磷酸化反应促使NF-κ B活化, 最终触发包括TNF-α 在内的多种细胞因子和趋化因子转录、释放。在此过程中, ASK1是p38蛋白和JNK活化的关键。细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号抑制剂不能影响TNF-α 释放, p38蛋白和JNK抑制剂均能显著降低TNF-α 的释放, 证实PE_PGRS33刺激TNF-α 释放依赖于p38蛋白和JNK信号通路。小鼠和人类巨噬细胞对PE_PGRS33蛋白的反应有所不同, 可能与TLR-2可变区在小鼠和人类存在多态性有关。

结核分枝杆菌表达的PE_PGRS 33蛋白具有定位线粒体的能力, 侵入细胞后通过线粒体途径诱导细胞凋亡^{[26, 27]}。目前研究未发现PE_PGRS33蛋白有线粒体靶向序列(mitochondrial targeting sequence, MTS), 蛋白主要依赖连接区将PGRS结构域定位于线粒体。与PE_PGRS 33蛋白有55%同源性的PE_PGRS 1不能定位线粒体, 提示PE_PGRS 33的PGRS结构域结合线粒体是特异的, 但还不清楚结核分枝杆菌将蛋白转位到线粒体上的确切路径以及信号传导的具体机制, 推测可能通过吞噬逃逸进入胞质或通过某个分泌系统与线粒体相互作用的结果, 也可能与TLR-2介导的内吞有关^[27]。PE_PGRS 33定位于转染或感染的哺乳动物真核细胞线粒体后, 检测发现细胞存活率明显下降, 凋亡和坏死细胞显著增高, 其中以凋亡为主。RT-PCR检测发现, PE_PGRS 33诱导后细胞Fas相关死亡结构域(fas-associated death domain, FADD) 蛋白和半胱氨酸蛋白酶(caspase)表达上调, 提示线粒体可能通过死亡受体途径或caspase8、9、3的依次活化, 释放凋亡信号诱导凋亡^[8]。广谱caspase 抑制剂ZVAD-FMK、caspase 8抑制剂均能阻断PE_PGRS 33诱导的细胞凋亡。值得注意的是, 缺失PE结构域或替换成家族其他蛋白的PE结构域, 虽然在线粒体上也能检测到蛋白表达, 但不能诱导明显的细胞坏死, 说明PE结构域在线粒体介导的细胞坏死中发挥重要作用。 另有研究显示^[24], PE_PGRS 33蛋白定位人巨噬细胞线粒体后诱导线粒体融合, 但不影响钙离子吸收、活性氧释放和线粒体膜电位。作为线粒体融合蛋白, PE_PGRS 33应该正调控机体的天然抗菌免疫, 但上述实验结果说明PE_PGRS 33可能通过调控某种信号通路抑制宿主的天然免疫应答, 具体机制有待研究。

结核分枝杆菌属于胞内寄生菌, 主要保护作用来源于细胞免疫, PE_PGRS33蛋白的T淋巴细胞抗原表位主要存在于PE结构域, 刺激细胞免疫应答。PGRS结构域的重复序列与EB病毒(Epstern Barr virus, EBV)富含甘氨酸和丙氨酸序列的核抗原1(EBV nuclear antigen EBNA-1)具有明显同源性, 推测可能有类似于EBNA-1的作用, 阻止PE结构域的抗原加工提呈, 通过抑制细胞免疫应答逃避宿主的免疫杀伤, 提升细菌胞内存活能力, 在结核分枝杆菌的潜伏感染(latent tuberculosis infected, LTBI)中发挥作用。此外, 有研究显示PE_PGRS蛋白家族存在无序结构区和无序蛋白, 在与宿主的相互作用中发生从无序到有序的结构改变, 从而影响宿主的免疫应答^[28]。PE_PGRS33蛋白是否也具有此种特性尚不清楚, 需深入探讨。