引用本文
张秋宇, 王峰, 孙乐, 陈施华, 岳磊, 严敏. 嗜吞噬细胞无形体表面蛋白P44研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(12): 1038-1043
ZHANG Qiu-Yu, WANG Feng, SUN Le, CHEN Shi-Hua, YUE Lei, YAN Min. Review of the outer membrane protein P44 of Anaplasma phagocytophilum [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(12): 1038-1043.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.170
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Copyright©2020, 中国人兽共患病学报
中国人兽共患病学报
嗜吞噬细胞无形体表面蛋白P44研究进展
张秋宇1, 王峰1, 孙乐1, 陈施华1, 岳磊2, 严敏1
1. 昆明医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系,昆明 650500
2. 中国医学科学院医学生物学研究所,昆明 650118
通讯作者:严敏,Email:yanmin0310606@163.com; ORCID:0000-0001-5201-4373; 岳磊,Email: yuelei0310@163.com; ORCID: 0000-0002-5211-4187
收稿日期: 2020-03-23
资助项目: 国家自然科学基金资助项目(No.31560271、No.81800012); 云南省科技计划项目省应用基础研究(昆医联合专项) 基金资助项目[No.2017FE467(-124)、No.2017FE467(-125)、No.2019FE001(-017)]; 云南省教育厅科学研究基金资助项目(No.2015C041Y)
摘要

P44是嗜吞噬细胞无形体 p44 /msp2基因家族编码的膜表面含量最多、研究最广泛的蛋白。其作为一个穿孔蛋白广泛参与病原体感染早期的黏附、入侵、免疫逃逸及新陈代谢等多种复杂生理活动,与嗜吞噬细胞无形体的致病机制密切相关,已成为当下研究的热点分子。本文就该蛋白分子的主要生理功能、分子生物学特性等方面对其进行全面阐述。

关键词: 嗜吞噬细胞无形体; p44 /msp2; 穿孔蛋白; 免疫逃逸
中图分类号:R378.5 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)12-1038-06
Review of the outer membrane protein P44 of Anaplasma phagocytophilum
ZHANG Qiu-Yu1, WANG Feng1, SUN Le1, CHEN Shi-Hua1, YUE Lei2, YAN Min1
1. Dept. of Pathogen Biology and Immunology, School of Basic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
2. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences, Kunming 650118, China
Corresponding authors: Yan Min,Email:yanmin0310606@163.com; Yue Lei,Email:yuelei0310@163.com
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31560271、No.81800012),Joint Special Project of Yunnan Science and Technology Department and Kunming Medical University [No.2017FE467(-124)、No.2017FE467(-125)、No.2019FE001(-017)] and the Science Research Fund Project of Yunnan Provincial Department of Education (No.2015C041Y).
Abstract

P44 is the most widely studied protein encoded by p44 /msp2 genes that is expressed on the membrane surface of Anaplasma phagocytophilum. It participates in many complex physiological activities, such as adhesion, invasion, immune escape and metabolism in early stages of infection. These functions are closely related to the pathogenesis of Anaplasma phagocytophilum and have been widely studied in recent research. In this review, the main physiological functions and molecular biological characteristics of P44 are systematically discussed.

Key words: Anaplasma Phagocytophilum; p44 /msp2; porin; immune escape

嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma Phagocytophilum, AP)是一种以感染人中性粒细胞为主的严格胞内寄生的革兰阴性短小球菌, 主要引起人粒细胞无形体病(Human Granulocytic Ehrlichiosis, HGE)。该病原体无鞭毛、无荚膜[1]等有助于黏附的结构, 其黏附和内化过程可能依赖于中性粒细胞表面高表达的P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)及唾液酸化和α -1, 3-岩藻糖化的sLex抗原(PS-GL-1N末端的帽结构), 相继使脾酪氨酸激酶(Syk)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)和GTP酶RhoA的效应激酶活化, 内化并寄生在细胞质空泡内, 以膜包裹的包涵体形式生存和繁殖[1]。

AP表面的多种组分在病原体入侵宿主时介导AP的黏附[2]、内化[3], 抑制中性粒细胞自噬[4]、抑制活性氧的产生[4]、清除外源性超氧化物、感知周遭环境变化、与宿主细胞进行物质交换和自身代谢[5]等众多重要生理活动。其中, P44作为AP膜蛋白中含量最多的蛋白, 占有重要的免疫原性主导地位, 并与AP致病机制有着密切联系[6], 已成为当下研究的热点之一。本文对近年来对P44蛋白的研究进展作一综述, 以期为P44蛋白在嗜吞噬细胞无形体致病中的作用提供参考。

1 P44基因结构及功能

P44(40 to 49 kDa)由p44/msp2多基因家族编码, 为AP含量最多的膜表面蛋白, 是AP主要的毒力因子和免疫主导蛋白[6]。P44为两亲性跨膜β -桶状外膜糖蛋白[7], 具有膜孔蛋白活性, 允许亲水小分子营养物质被动扩散[4]。P44结构主要特征包括β 反向平行折叠、极性残基和C-末端的苯丙氨酸[8], 由约94个氨基酸残基的中心高变区和约52个氨基酸的N端和56个氨基酸的C端保守区[9], 或是N端和高变区之间的亚保守区域(约占37%)氨基酸系列折叠而成[10]。两末端(N端和C端)为16次跨膜, 少数为18次跨膜[11]。P44高变区构成了胞外暴露环, 不会对P44蛋白质的二级结构造成较大影响, 表明不同株P44结构应无较大差异[10]。AP基因组(GenBank:CP000235)为单股环状染色体[12], 无质粒、无完整前噬菌体、无转座元件, 全长1.47 Mb, 共1 369个ORFs(Open Reading Frameworks, ORFs)。GC%占41.6%, 所有AP菌株均具有 p44 基因[13]。AP基因组含有许多重复序列、p44和AnkA 两个特征基因及编码IV 型分泌系统(T4S)的基因[4], P44编码基因包括两个ORFs, 其中一个编码P44同源蛋白(1 323 bp), 另一个则编码P44/Msp2(825 bp), 此外尚存在一些少数的基因内间隔区ITS(Intergenic Sequences, ITS)[14, 15]。

P44是msp2/p44基因编码的AP特征性膜表面蛋白, 该基因包括3个omp-1、1个msp2、2个msp2同源基因、1个msp4和113个编码OMP-1/MSP2/P44蛋白超家族的基因位点[14]。AP感染HL-60细胞后约有110种P44蛋白表达, 这些蛋白主要介导黏附、内化、与宿主细胞间的相互作用[17]、免疫逃逸及生长代谢等活动[10]。不同分离株的一些P44同源蛋白构成了序列簇相似度大于90%的相似簇, 每个簇的同源蛋白相似区域通常为某些配体的编码基因[18]。

2 P44生理特性与功能
2.1 黏附

对于胞内感染的病原体, 黏附分子是其入侵宿主细胞引起感染诱发疾病的先决条件。Park等采用单克隆抗体(MAb)和重组P44(rP44)对中性粒细胞进行封闭或拮抗处理, 同时用rP44阻断PSGL-1 MAb与中性粒细胞的结合, 结果指出P44 可以作为一种黏附素促使AP黏附到中性粒细胞表面的岩藻糖基化和唾液酸化的骨架蛋白上, 主要为P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1/CD162)[2, 16, 19]。除 P44寡聚体外还含有一些其他膜蛋白如Asp14、OmpA、AipA、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白和Flotillin 1等参与构成AP黏附复合物[20, 21, 22]。由于P44由多基因家族表达具有多样性, 尚不能表明所有的P44蛋白分子均具有黏附作用, 然而Abraham等指出, 菌体黏附分子的表达具有高度保守性, 不同菌株中表达各异的P44分子参与黏附的成分应无太大差异[23]。人髓系细胞向粒细胞分化成熟时, 可发生某些酶或其它蛋白成分水平发生变化, 如CD11b/CD18(Mo1) 表达逐渐剧增、髓过氧化物酶(MPO)表达水平骤降等[24]。研究表明外周成熟中性粒细胞的AP感染率明显高于骨髓中未成熟的中性粒细胞[25], 其机理可能与不同分化阶段的中性粒细胞表面表达成分的不同有关, 提示分析不同分化阶段中性粒细胞膜表面分子的表达情况及其各自信号通路, 有助于进一步阐明P44的致病机理。

2.2 诱导细胞因子产生

AP刺激机体产生大量细胞因子, 引发细胞因子风暴(Cytokine storm)为疾病损伤的重要机制之一, 其中, P44蛋白在诱导外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte, PBL)产生促炎细胞因子中起着主要作用[26]。将PBL(淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞)与AP共同孵育, 采用逆转录PCR(RT-PCR)和捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)2 h后测定到3种细胞均表达IL-1, 单核细胞此外还表达TNF-β 和IL-6, 并呈剂量依赖性。相比较而言细胞因子IL-8、IL-10、IFN-γ 、TGF-β 和IL-2 mRNA的表达不明显[27]。同时采用rP44替代AP刺激PBL产生以上3种细胞因子可达到相似的动力学效应, 表明AP表面蛋白P44可能与PBL进行相互作用。蛋白酶K可阻断其诱导3种细胞因子的能力[27]。研究表明P44诱导这些细胞因子的表达可能是由转录因子NF-κ B介导的[26], 其间涉及到了病原体与宿主中性粒细胞和单核细胞之间不同信号的传递[28]。

AP感染患者的临床症状和血液学异常可能与P44刺激血液中产生高水平的IL-1β 、TNF-α 和IL-6有关, 其严重程度与血清中高水平的IFN-γ 、IL-10、IL-12和铁蛋白有关[26]。由于P44基因表达多样性, 不同P44基因产物诱导促炎细胞因子基因表达的能力可能存在差异[27], 从而在临床上表现出疾病的严重程度不一, 影响疾病的转归以及宿主免疫的发展。中性粒细胞作为AP的宿主细胞, 在IFN-γ 刺激下可通过不依赖诱导型一氧化氮合酶的机制起着杀伤作用 [29], 但产生细胞因子的作用不明显。

2.3 穿孔蛋白活性

AP胞膜为内膜和外膜构成的磷脂双分子层结构, 位于外膜的P44可发挥孔蛋白作用以被动扩散的形式从外界获取糖类、氨基酸、离子等亲水性物质[30, 31, 32]。脂质体肿胀实验表明P44的穿孔特性能介导谷氨酰胺、阿拉伯糖(单糖)、蔗糖(二糖)、木苏糖(四糖)、抗生素等多种物质的被动扩散[10]。

P44的穿孔特性主要由其二级结构决定, P44穿孔蛋白结构为寡聚体或异聚体, 通过数目的变化调节转运活性[19]。AP基因组缺少一个异柠檬酸脱氢酶基因(GenBank: CP000235), 其所含的GMP合成酶(GenBank:YP_505762)可将L-谷氨酰胺转化为L-谷氨酸, 但L-谷氨酰胺或L-谷氨酸的获取需借助P44外源获得, 因此P44尚与自身能量代谢密切相关[10]。Ap在HL-60细胞系中进行复制时, P44表达上调, 提示孔蛋白功能或许在此过程发挥着一定作用[31]。P44的穿孔活性可被其特异性抗体MAb 5C11封闭, 由此得知, AP多态性表达的p44除了提供抗原变异外[33, 34]介导免疫逃逸, 还能在不同条件下获得适宜的穿孔蛋白相关生理功能。

3 P44的抗原变异

P44由AP主要外膜蛋白超家族编码基因msp2/p44编码, 这些基因可在某个主要表达领域易发生片段交换, 从而使机体出现不同的P44外膜蛋白产生抗原变异[32]。有实验表明, 特异性抗体识别P44表位明显的延迟, 甚至较立克次体血症还要滞后, 进一步证实了宿主的免疫反应可使AP的P44发生抗原多态性转化[33]。由于AP不具有RecBCD酶系统, P44基因的转换及同源重组主要通过RecFOR酶体系(RecF途径)来实现, 根据自身的适应需求, 选择适宜表达的 P44 外膜蛋白种类, 从而表现出P44抗原多态性的特点[15, 27]。p44多基因家族包含了很多缺乏翻译起始点功能性假基因, 基因的多态性发生的本质是部分或者全部的假基因(不具备转录起始点)[34, 35]插入到转录过程中单顺反子表达位点使其融合所致, 也即阶段性基因转换[33], 在RecF途径基因重组后仍可使全长的P44蛋白(44 kDa)得以表达[35]。

P44抗原多样性表现在不同地域、不同种宿主、致病机制存在差异的菌株, 甚至是同一患者的不同组织细胞中[6, 32], 尽管在同一国家的同一种宿主中, P44基因有着高度相似变异度(7.24%~98.85%)[36]。例如, 国内分离株AP P44表面蛋白上B淋巴细胞表位明显较HZ和Webster菌株多[37, 38], 且在核苷酸序列、氨基酸序列以及蛋白质的二级和三级结构间均有着明显不同[6]。不同细胞系培养的AP有着血清学反应差异[32], P44-18、P44-47E和P44-60转录本在THP-1中主要表达, P44-78和P44-51分别于NB4和RF/6A细胞中主要表达, P44-18ES则主要表达于HL-60细胞系中[39], 甚至在同一细胞系(HL-60.1和HL-60.2)中, P44表达转录本也可能发生明显的偏移[40]。P44的抗原变异, 使得病原体能够逃避宿主的适应性免疫应答, 继而引起后续的临床症状[41, 42]。基因表达的多样性经常导致新的基因功能或假基因的出现, 有助于AP适应新的环境, 同时导致AP感染能力菌株差异性的产生[43, 44]。

4 P44在临床诊断中的应用

AP感染实验室相关检测主要有检测抗AP抗体的间接免疫荧光技术(IFA)、 ELISA 以及扩增血标本中病原体16S r RNA、groESL(Heatshock protein, groESL)、AnkA蛋白、P44蛋白的基因序的常规PCR、双重实时定量PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)等[9, 33]。其中, 扩增特异性核酸有着较高的敏感度, 可用于感染早期的诊断。IFA虽应用最为广泛, 但其抗原质量要求较高, 价格昂贵, 不适宜感染早期(< 7 d)的检测[45]。

人体在感染AP后可形成多种抗 P44 抗体, 以 P44 为诊断抗原的做ELISA检测, 相较于IFA具有成本低、操作简单、结果可靠、特异性强、灵敏度高(80%~90%)[46]、漏检率低及可自动化等特点[15, 47, 48]。Su H等采用HL-60培养当地AP菌株作为血清学检测抗原作ELISA, 指出其灵敏度显著高于IFA[9]。实验采用重组蛋白rP44-18ES、rP44-47E、r P44-60、rP44、rP44-2等对其进行检测后发现与常规 IFA 结果相符, 证实了重组P44抗原用于AP血清学检测的可行、有效性[32, 46, 49]。因P44抗原具有多态性, 多种P44相关蛋白可能参与IFA中的免疫反应, 利用与4例HGA患者血清反应的多肽阵列鉴定了3个P44相关蛋白上的12个B细胞表位, 用这12个表位合成的14个多肽作为抗原, 对不明原因发热患者进行多肽斑点免疫测定, 发现其灵敏度和诊断效率较Western blot测定3种常用的重组蛋白(rP44-18ES、rP44-47E和/或rP44-60)有着明显的提高[9, 39]。由于P44参与黏附过程, 在使用低光谱度rP44检测患者血清时, 可能会出现假阳性的血清学结果[50]。

5 结 语

研究表明, P44为AP膜表面由多基因家族p44编码而成重要的免疫性分子, 在AP致病机制中发挥着介导黏附、内化、抑制中性粒细胞自噬等作用。由于抗原性多样性的存在, 使其在入侵宿主过程中得以免疫逃逸。P44具有穿孔蛋白活性, 本身是一个跨膜的亲水性通道, 可被动转运所需营养物质, 同时辅助TAC的顺利进行。P44为AP的主要免疫原性蛋白, 利用ELISA检测rP44可广泛用于临床AP感染的血清学诊断, 灵敏度高达80%~90%[46]。目前, 利用P44研发疫苗一论尚存在争执, 但其生物学功能与AP的致病机制密切相关, 仍是目前研究的热点。

利益冲突:无

引用本文格式:张秋宇, 王峰, 孙乐, 等.嗜吞噬细胞无形体表面蛋白P44研究进展[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(12):1038-1043. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.170

编辑:王晓欢

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