引用本文
赵亚男, 曾德新, 郭德华, 蒋原, 蒋鲁岩, 李鑫妮, 陈伟, 汤芳, 薛峰, 戴建君. 一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157:H7检测方法的建立及应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(4): 272-279
ZHAO Ya-nan, ZENG De-xin, GUO De-hua, JIANG Yuan, JIANG Lu-yan, LI Xin-ni, CHEN Wei, TANG Fang, XUE Feng, DAI Jian-jun. Establishment and application of a rapid detection method for Escherichia coli O157:H7 in beef [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(4): 272-279.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.036
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中国人兽共患病学报
一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157:H7检测方法的建立及应用
赵亚男1, 曾德新1, 郭德华2, 蒋原2, 蒋鲁岩3, 李鑫妮4, 陈伟4, 汤芳1, 薛峰1, 戴建君1
1.南京农业大学动物健康与食品安全国际合作实验室,南京 210095
2.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心,上海 200135
3.南京海关动植物与食品检测中心,南京 210001
4.合肥工业大学食品与生物工程学院,合肥 230601
通讯作者：薛峰,Email:xuefeng@njau.edu.cn; ORCID:0000-0001-8378-5226
收稿日期: 2019-06-20
资助项目: “十三五”国家重点研发计划重点专项(No.2018YFC1603600); 南京海关科研项目(No.2018KJ32); 江苏省农业自主创新项目(No.CX(18)2011)
摘要
目的 建立一种快速、准确检测牛肉中大肠杆菌O157:H7的方法。方法 利用抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体2G5(捕获抗体),酶标单克隆抗体2E3(HRP-2E3,检测抗体),建立可用于检测大肠杆菌O157:H7的双抗体夹心ELISA方法,同时对反应条件进行优化并对该方法进行评价。结果 通过优化得到最佳反应条件,单克隆抗体2G5最佳包被浓度为4.48 μg/mL,HRP-2E3最佳检测浓度为19.9 μg/mL。该方法对纯培养菌液最低检出限为 1×105 CFU/mL,具有良好的敏感性,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等均无交叉反应。板内及板间变异系数均小于7%,具有较高的精密度。人工污染牛肉样品增菌8 h后,对大肠杆菌O157:H7的检出限为1 CFU/25 g。结论 建立的双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度、准确度、重复性良好,特异性强,可用于临床实际样品检测。
关键词: 大肠杆菌O157:H7; 双抗体夹心ELISA; 单克隆抗体; 牛肉
中图分类号:S852.61 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)04-0272-08
Establishment and application of a rapid detection method for Escherichia coli O157:H7 in beef
ZHAO Ya-nan1, ZENG De-xin1, GUO De-hua2, JIANG Yuan2, JIANG Lu-yan3, LI Xin-ni4, CHEN Wei4, TANG Fang1, XUE Feng1, DAI Jian-jun1
1. International Cooperative Laboratory for Animal Health and Food Safety, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
2. Shanghai Customs Animal and Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center, Shanghai 200135, China
3. Nanjing Customs Animal and Plant and Food Testing Center, Nanjing 210001, China
4. College of Food and Bioengineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601, China
Corresponding author:Xue Feng, Email:xuefeng@njau.edu.cn
Abstract
To establish a rapid and accurate method for the detection of Escherichia coli O157:H7 in beef. The anti- E. Coli O157:H7 monoclonal antibody 2G5 as capture antibody and enzyme-labeled monoclonal antibody 2E3 (HRP-2E3) as detection antibody were used to establish a double-antibody sandwich ELISA method for detecting E. coli O157:H7. Then, the reaction conditions and the method were optimized. The optimal coating concentration of monoclonal antibody 2G5 was 4.48 μg/mL, and the optimal detection concentration of HRP-2E3 was 19.9 μg/mL . The limit of detection (LOD) of E. coli O157:H7 reached 105 CFU/mL, showing in good sensitivity. Also, this method had no cross-reaction with other Escherichia coli, Salmonella, Listeria, etc, which showed high specificity. Variable coefficient of intra-and inter-plate were all less than 7% showing high precision. LOD of E. coli O157:H7 in artificial contamination of beef samples was 1 CFU/25g after enrichment for 8h. Thus, the established sandwich ELISA method has good sensitivity, specificity and reproducibility. It can be used for the detection of clinical actual samples.
Key words: Escherichia coli O157:H7; double-antibody sandwich ELISA; monoclonal antibody; beef

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种危害严重的人兽共患病原体, 主要通过受污染的食物传播, 如牛肉、奶制品、蔬菜和水果[1]。反刍动物, 特别是牛, 是大肠杆菌O157:H7的主要宿主[2, 3]。虽然大肠杆菌O157:H7对成年牛没有致病性, 但却可以导致人的出血性腹泻、溶血性尿毒症综合征(HUS)以及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。人的感染剂量一般很低, 摄入10个活菌就足以引起感染[4, 5], 幼儿最容易感染这种微生物[6, 7]。由它引起的溶血性尿毒综合征可导致红细胞的破坏和肾功能衰竭。据报道, 全球平均每年有3 890例溶血性尿毒症病例, 死亡人数达230人[8]。自1982年在美国首次被分离出来, 并被认为是一种新型的肠道致病菌[9], 美国又发生了多起该病的暴发流行[10, 11]。此外, 加拿大[12]、日本[13]等多个国家相继发生此病原菌引起的暴发感染。我国受此病原菌的威胁也越来越大, 自1986年在江苏徐州首次发现以来, 福建、甘肃、安徽等省先后自人畜以及其他动物中分离出O157大肠杆菌[14]。

因此, 大肠杆菌O157:H7的检测在食品安全、疾病控制、环境保护等领域受到广泛的关注。鉴于现在主流的检测方法, 如国标法金标准, 其检测灵敏度高, 但工序复杂, 检测时间长, 并对检测人员要求高[15], 使其无法及时预防疫情的暴发; 如分子生物学方法, 其时效快, 成本低, 但特异性易受引物、环境等因素影响而产生假阳性或假阴性结果[16]。而基于单克隆抗体的ELISA方法检测病原体具有简单、灵敏度高、特异性好等优点。因此本研究利用抗O157:H7特异性单克隆抗体2G5及辣根过氧化物酶标记单克隆抗体2E3 (HRP-2E3), 建立双抗体夹心ELISA方法, 为大肠杆菌O157:H7提供可靠的检测方法。

1 材料与方法
1.1 菌株与抗体

38株O157:H7和沙门氏菌、志贺杆菌等29株菌种由南京农业大学动物医学实验室保存(见表2), 本次实验所用的2株大肠杆菌O157:H7单克隆抗体(2G5、2E3)的杂交瘤细胞由南京农业大学动物医学实验室筛选获得。

1.2 主要试剂与设备

脱脂奶、BSA、Tween 20购自南京鼎思生物技术有限公司, 10× PBS购自北京索莱宝生物科技有限公司, TMB单组份显色液、辣根过氧化物酶购自Sigma公司, PCR Kit 购自Takara公司, DNA提取试剂盒购自 TIANGEN公司, 新生霉素增菌肉汤购自北京陆桥公司, PCR仪为美国ABI公司, 电泳仪、凝胶成像系统均为上海天能公司, 酶标仪为西班牙基立福公司。

1.3 PCR引物设计与合成

以大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfbE[17, 18]为目的基因, 参考陈雅君等[19]报道的引物序列(表1), 委托金斯瑞生物技术有限公司合成。

表1 rfbE基因引物序列及预计扩增长度 Tab.1 Primer sequence of rfbE and expected amplification length
1.4 单克隆抗体的纯化与标记

冻融实验室存储的单克隆抗体腹水, 根据Protein A预装重力柱(上海斯信生物技术有限公司)说明书进行纯化并进行SDS-PAGE分析, 测定单抗纯度后冻存于-80 ℃备用。

取纯化后的单克隆抗体2E3, 与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联, 得到酶标记抗体(HRP-2E3)。采用过碘酸钠法进行标记[20], 原理是过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基, 可与加入的IgG上的氨基形成Schiff氏碱而结合。

1.5 双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以2G5为捕获抗体, 辣根过氧化物酶标记单克隆抗体2E3(HRP-2E3)为检测抗体建立双抗体夹心ELISA 检测方法。具体步骤如下:①抗体包被:将2G5用包被液稀释至一定浓度后包被酶标板, 每孔100 μ L, 4 ℃包被过夜; ②封闭:PBST洗涤3次后, 每孔300 μ L封闭液于37 ℃进行封闭; ③加抗原:PBST洗涤3次, 拍干, 加入待测菌液, 每孔100 μ L, 37 ℃孵育; ④加酶标抗体:PBST洗3次, 拍干, 酶标抗体(HRP-2E3)稀释至适宜浓度后, 每孔100 μ L, 37 ℃孵育; ⑤加底物显色:洗板4次, 拍干后每孔加入100 μ L TMB单组份显色液, 置于37 ℃避光显色; ⑥终止:用2 mol/L H2SO4终止反应, 每孔100 μ L, 于450 nm波长处测各孔OD值。

为了得到最优检测体系, 分别对2G5包被浓度(1:100、1:200、1:400、1:800), HRP-2E3检测浓度(1:100、1:200、1:400、1:800)[21], 封闭液(1%BSA、2%BSA、10%BSA、1%明胶、2%明胶、5%脱脂奶), 最佳封闭时间(60 min、90 min、120 min), 抗原作用时间(45 min、60 min、90 min、120 min), 酶标抗体作用时间(45 min、60 min、90 min、120 min)以及显色液显色时间(5 min、10 min、15 min、20 min)进行优化。

1.6 双抗体夹心ELISA灵敏度的检测

将大肠杆菌O157:H7培养至对数期(OD600=0.6, 平板计数确定浓度为1× 108 CFU/mL), 0.4%甲醛灭活24 h后, 用无菌PBS进行10倍比稀释得 10~108 CFU/mL浓度菌液, 按照已优化好的最佳条件进行双抗体夹心ELISA检测, 每个浓度做3孔平行检测, 确定灵敏度。

1.7 双抗体夹心ELISA特异性的检测

受试菌株包括38株O157:H7和29株其它菌种, 菌浓度均为108 CFU/mL, 验证建立的双抗体夹心ELISA方法的特异性, 同时使用国标方法及PCR方法进行对比验证。

1.8 双抗体夹心ELISA重复性的检测

板内重复性检测, 选取1× 108、1× 107、1× 106、1× 105 CFU/mL这4个浓度进行分析, 每个浓度做5个重复, 计算其板内变异系数。板间重复性检测, 选择同样的浓度在5块不同的酶标板上不同时间进行检测, 计算其板间变异系数。

1.9 样品检测

1.9.1 模拟样品检测 构建人工污染牛肉样品, 使用建立的双抗体夹心ELISA检测方法, PCR检测方法和国标培养法对比检测, 验证所建立的双抗体夹心ELISA检测方法的实用性。

牛肉样品(购自南京农业大学附近农贸市场), 用超纯水冲洗干净后经组织捣碎机加工成肉馅, 用国标培养法确定无O157:H7自然污染后, 置于高压灭菌锅内121 ℃灭菌20 min。冷却后, 人工污染大肠杆菌O157:H7, 接种剂量分别为104、103、102、10、1 CFU/25 g, 每个接种量设置3个平行, 并以无菌生理盐水作空白对照, 取各浓度剂量人工污染样品和空白无污染样品25 g于 225 mL 新生霉素增菌肉汤, 使用拍击式均质器连续均质2 min, 在37 ℃, 100 r/min摇床增菌培养。

增菌至4、6、8、10 h, 分别从各浓度增菌液和空白菌液取3份样品, 每份1 mL, 800 r/min离心3 min去除沉渣, 吸上清, 10 000 r/min离心5 min, PBS洗涤3次, 重悬后煮沸10 min, 用上述建立的双抗体夹心ELISA方法检测; 同样取4、6、8、10 h增菌液, 每份1 mL, 设3个平行对照, PBS洗涤去除油脂和沉渣后, 使用TINAGEN试剂盒说明书提取DNA, 参考陈雅君等[19]报道的PCR扩增体系进行PCR检测; 参照GB 4789.36-2016, 增菌24 h后, 对不同浓度人工污染样品和空白无污染样品进行国标法检测。

1.9.2 实际样品检测 从南京农业大学附近的农贸市场、超市采集100份样品(牛肉40份、猪肉20份、鸡肉20份、鲜奶20份), 用已建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测, 同时采用国标(GB 4789.36-2016)对比检测。

2 结 果
2.1 SDS-PAGE检测纯化后2E3、2G5抗体纯度

结果见图1, 在50 kDa和25 kDa处分别出现两条蛋白带, 它们分别与鼠IgG重链和轻链的分子量相符合, 说明纯化效果比较好。

图1 纯化前后2E3、2G5单抗的SDS-PAGE分析
注:M为蛋白Marker; 1为纯化前2E3; 2为纯化后2G5; 3为纯化前2G5; 4为纯化后2G5Fig.1 SDS-PAGE analysis of monoclonal antibodies (2E3 and 2G5) before and after purification

2.2 2G5和HRP-2E3工作浓度的测定

方阵法测定结果见表2, 基于检测效果和经济性考虑, 选择2G5抗体1:400稀释(4.48 μ g/mL), HRP-2E3抗体1:100稀释(19.9 μ g/mL)为最终工作浓度, 此时阳性值OD450≈ 1, P/N值为26.15。

表2 2G5和HRP-2E3工作浓度测定结果 Tab.2 Results of working concentrations of 2G5 and HRP-2E3
2.3 最佳封闭液及封闭时间的优化

封闭对ELISA反应至关重要, 可以减少非特异性吸附, 提高反应的灵敏度及特异性。以阳性孔OD450值与阴性对照孔OD450值之比(P/N值)最大为最优条件, 经测定5%脱脂奶为最适封闭液(图2A), 1.5 h为最佳封闭时间(图2B)。

图2 最适封闭液及封闭时间的确定
注:A最适封闭液的确定; B最佳封闭时间的确定Fig.2 Determination of optimal blocking solution and blocking time

2.4 抗原、酶标抗体及显色液作用时间的优化

反应时间的长短会对OD450nm值产生影响, 为提高反应的特异性和灵敏度, 本次实验分别对抗原、酶标抗体及显色液作用时间进行优化, P/N值最大判定为最优条件。结果如图3所示, 抗原、酶标抗体(HRP-2E3)、TMB单组份显色液最佳作用时间分别为90 min(图3A)、45 min(图3B)、10 min(图3C)。

图3 抗原、酶标抗体及显色液作用时间的优化Fig.3 Optimization of reaction time of antigen, enzyme-labeled antibody and chromogenic liquid

2.5 双抗体夹心ELISA灵敏度检测

对10~108 CFU/mL的8个浓度梯度的菌液进行检测, 结果如图4所示, 每个浓度做3个平行, 随着抗原浓度的降低, 检测OD450nm值也随之下降(见图4A), 以测定孔与阴性孔OD值之比大于2.1为阳性的判断标准, 本方法对大肠杆菌O157:H7的检测限为 1× 105 CFU/mL, 此时比值为2.21(见图4B)。

图4 双抗体夹心ELISA灵敏度检测
注:A为每个稀释度的OD450nm值; B为每个稀释度的P/N值Fig.4 Sensitivity test of established double-antibody sandwich ELISA

2.6 双抗体夹心ELISA检测方法的特异性

同时使用建立的双抗夹心ELISA方法、PCR检测法和国标方法对38株大肠杆菌O157:H7和29株其他菌株进行特异性检测, 结果见表3。ELISA检测方法和国标法相同, 38株大肠杆菌O157:H7检测结果显示阳性, 其他29株菌株检测结果为阴性, 与预期结果一致, 显示了高度的特异性。PCR检测法和其他两种方法的检出结果也基本一致, 但是温和气单胞菌出现了假阳性结果, 可见相比培养法和免疫学检测方法, PCR等分子生物学检测方法在特异性方面还存在一定的弊端。

表3 特异性检测实验结果 Tab.3 Results of specific test
2.7 双抗体夹心ELISA重复性检测

由检测结果可知, 板内变异系数小于5%(见表4), 板间变异系数小于7%(见表5), 板间变异系数略大于板内变异系数, 可能是由于每天环境条件不同, 如温度和湿度变化有关, 也可能与溶液的再制备有关, 但均小于10%, 说明建立的ELISA检测方法具有较好的重复性和精密度[22, 23]。

表4 板内重复性检测结果 Tab.4 Results of intraplate repeatability test
表5 板间重复性检测结果 Tab.5 Results of interplate repeatability test
2.8 样品检测

2.8.1 牛肉模拟样品检测 双抗体夹心ELISA检测结果见表6, 以测定孔与阴性孔OD值之比大于2.1为阳性的判断标准, 增菌4 h、6 h、8 h、10 h后, 检测灵敏度分别为102 CFU/25 g、10 CFU/25 g、1 CFU/25 g、1 CFU/25 g。可见经8 h增菌培养后, 建立的ELISA检测方法对牛肉中大肠杆菌O157:H7的检测限可达1 CFU/25 g。

普通PCR检测结果见图5, 每个稀释度设3个平行, 增菌4 h、6 h、8 h后, 检测灵敏度分别为104 CFU/25 g、102 CFU/25 g、10 CFU/25 g, 增菌10 h后, 才可检测到1CFU/25 g, 且阳性条带较浅。阴性样品均无条带, 说明检测过程无污染。该方法增菌8 h后对牛肉样品检测灵敏度只能达到10 CFU/25 g, 比ELISA检测降低一个数量级。

按照国标法操作规范对不同浓度污染样品和无污染样品进行检测, 经可疑菌落挑选和大肠杆菌O157:H7干制生化鉴定试剂盒鉴定, 各浓度污染样均为检测阳性, 且空白样为检测阴性, 说明国标培养法检测灵敏度很高, 达1 CFU/mL, 但是其检测周期较长, 需7 d左右, 对于有些H鞭毛不易凝集的菌株, 其检测周期更长。

表6 牛肉模拟样品检测结果 Tab.6 Results of beef simulation sample test

图5 样品增菌4、6、8、10 h rfbE基因扩增结果
注:A为增菌4 h; B为增菌6 h; C为增菌8 h; D为增菌10 h; 1-3为104 CFU/25 g; 4-6为103 CFU/25 g; 7-9为102 CFU/25 g; 10-12为10 CFU/25 g; 13-15为1 CFU/25 g; 16-18为阴性样品; 19为阳性对照; 20为阴性对照Fig.5 Results of rfbE gene amplification after sample enrichment for 4, 6, 8 and 10 h

2.8.2 实际样品检测 用已建立的夹心ELISA检测方法和国家标准方法(GB 4789.36-2016)分别对100份样品进行检测, 两种方法结果一致, 均为阴性, 进一步证明了所建立方法的准确性和实用性。

3 讨论

大肠杆菌O157:H7是一种严重的食源性致病微生物, 常常引起食品安全事故, 威胁着我们的生命安全[24, 25]。因此, 建立高效、快速的检测方法是预防和及时发现该暴发的关键因素。单克隆抗体因其具有专一的特异性, 性质稳定, 一经制备可长时间获得等优势而广泛应用于疾病的诊断。因此, 本实验利用前期制备的2株抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体建立夹心ELISA检测方法。该免疫学方法具有灵敏度高、特异性强和检测周期短等优点。

包被是双抗体夹心ELISA实验非常重要的一步, 若抗体包被浓度过低, 不能完全覆盖固相载体表面, 使捕获抗体吸附的抗原量不够, 则可能出现假阴性; 若包被浓度过高, 抗体分子间的相互作用就会造成蛋白分子层叠, 在随后的洗涤过程中, 这些抗体容易被洗去, 影响实验的灵敏度。制得的酶标记抗体需要确定其最适工作浓度, 浓度过高, 则可使非特异性反应增加, 阴性结果偏高; 而浓度过低又可影响测定的敏感性。所以本实验通过方阵法, 确定了最佳的抗体包被浓度(4.48 μ g/mL)和酶标抗体反应浓度(19.9 μ g/mL)。

为了验证建立的双抗体夹心ELISA检测方法的实用性, 设计人工污染牛肉样品, 用ELISA检测法同PCR和国标培养法进行对比检测, 从灵敏度、检测时长等因素综合分析, 展现其在实际样品检测中的优越性。结果显示, 选择性前增菌8 h后, ELISA检测灵敏度可达1 CFU/25 g, 比PCR检测高一个数量级。国标法需增菌18~24 h, 才可达到1 CFU/25 g的检测灵敏度; 而完成整个检测过程, ELISA只需5~6 h, 而国标培养法则需要7 d乃至更长时间。由此可见, 建立的ELISA检测法集合了国标培养法检测灵敏度高、特异性强和PCR法检测周期短的优点, 更能满足实际应用的需求。

本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法对污染样品的检测灵敏度高于吴大成等[14]采用双抗体夹心ELISA的检测方法, 增菌培养12 h后, 最低检测限为0.4~4 CFU/g; 黄海燕等[26]40 ℃增菌8 h检测限为2 CFU, 即 0.08 CFU/g; 以及宋宏新等[27]增菌14 h, 检测线为0.1~0.2 CFU/g。因此, 本检测方法具有较好的特异性及灵敏度, 可用于实际样品中大肠杆菌O157:H7检测。

综上所述, 本次实验建立的双抗夹心ELISA检测方法特异性、灵敏度、精密度良好, 优于国标法及普通PCR检测。但是最近有学者[28]用一种新的方法(纸基夹心ELISA)检测大肠杆菌, 该方法检测快速, 不需依赖酶标仪等昂贵仪器, 整个操作过程不到1 h, 并且其最低检测限为1× 105 CFU/mL, 灵敏度较高, 可以用于现场即时检测。可以预见如将所建立的ELISA体系应用于纸基微流控芯片, 建立纸基夹心ELISA检测方法, 将会大大缩短检测的时间及成本, 取得更为可观的效果。

利益冲突:无

引用本文格式:赵亚男, 曾德新, 郭德华, 等.一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157:H7检测方法的建立及应用[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(4):272-279, 296. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.036

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