引用本文
虞秀锋, 王启源, 姬文兰, 王亚梅. MiR-506-3p/SOCS-3促进BCG感染巨噬细胞引发的炎症应答反应[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(4): 297-302
YU Xiu-feng, WANG Qi-yuan, JI Wen-lan, WANG Ya-mei. MiR-506-3p/SOCS-3 promotes inflammatory responses in BCG-infected macrophages[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(4): 297-302.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.184
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中国人兽共患病学报
MiR-506-3p/SOCS-3促进BCG感染巨噬细胞引发的炎症应答反应
虞秀锋, 王启源, 姬文兰, 王亚梅
陕西省结核病防治院内四科,西安 710100
通讯作者：姬文兰,Email:wenlanji66@163.com; ORCID:0000-0002-7768-264X
收稿日期: 2019-04-29
摘要
目的 探究miR-506-3p在卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染巨噬细胞诱导的炎症应答进程中的作用及其机制。方法 制备BCG感染巨噬细胞RAW264.7模型;采用RT-PCR检测miR-506-3p及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达水平;利用ELISA方法测定炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平;用Griess法评估NO的分泌情况;CFU计数法评估BCG存活率;应用双荧光素酶报告实验、RT-PCR及Western Blot法验证miR-506-3p与SOCS-3的靶向调控关系。结果 BCG感染能够引起RAW264.7细胞中miR-506-3p的表达量显著下调,并且具有时间依赖性。另外,miR-506-3p过表达后可显著增加BCG感染的RAW264.7细胞中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平。同时,miR-506-3p上调能够明显增加BCG感染后RAW264.7中NO的产生及iNOS的表达。此外,过表达miR-506-3p可明显降低胞内BCG的存活率。更为重要的是miR-506-3p能够靶向结合SOCS-3的3'-UTR,并可负调控其表达。结论 MiR-506-3p通过抑制靶基因SOCS-3从而促进BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症反应进程,从而导致胞内BCG的存活率降低,有望为结核病的临床研究和治疗提供一个新的潜在靶点。
关键词: 结核分枝杆菌; MiR-506-3p; 炎症应答; 巨噬细胞
中图分类号:R521 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)04-0297-06
MiR-506-3p/SOCS-3 promotes inflammatory responses in BCG-infected macrophages
YU Xiu-feng, WANG Qi-yuan, JI Wen-lan, WANG Ya-mei
Department of Fourth Medicine, the Tuberculosis Control and Prevention Hospital of Shaanxi Province, Xi'an 710100, China
Corresponding author:Ji Wen-lan, Email:wenlanji66@163.com
Abstract
To explore the potential role and the underlying molecular mechanisms of miR-506-3p in BCG-infected inflammatory responses of macrophages. The BCG-infected RAW264.7 cell model was established. RT-PCR assay was performed to detect the expression of miR-506-3p and inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6 and iNOS. ELISA assay was conducted to measure the level of inflammatory mediators. Griess assay was apply to evaluate the production of NO. The BCG survival was assessed using colony-forming unit (CFU) assay. Dual-luciferase reporter assay system, Western blot and RT-PCR were used to confirm the interaction between the miR-506-3p and 3'-UTR of SOCS-3.We observed that the expression of miR-506-3p was declined in a time-dependent manner in BCG-stimulated RAW264.7 cells. In addition, overexpression of miR-506-3p remarkably enhanced the accumulation of inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 in BCG-infected RAW264.7 cells. Meanwhile, introduction of miR-506-3p obviously increased NO production and iNOS expression in BCG-challenged RAW264.7 cells. Moreover, introduction of miR-506-3p inhibited BCG survival. More importantly, the dual-luciferase reporter assay system, RT-PCR and Western Blot assay demonstrated that miR-506-3p could suppress SOCS-3 expression by targeting the specific 3'-UTR sequence of SOCS-3 gene. These findings demonstrated that miR-506-3p enhanced BCG-triggered inflammatory responses and suppressed BCG survival in BCG-infected macrophages by targeting SOCS-3, which may provide a promising therapeutic target for Tuberculosis treatment.
Key words: Mycobacterium tuberculosis (MTB); miR-506-3p; inflammatory responses; macrophages

结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染所引起的人兽共患的慢性呼吸道传染疾病。只有深入的了解MTB感染与机体免疫细胞之间的作用机制及相关分子基础, 才能更好地预防和控制结核病。MTB作为一种典型的胞内寄生菌, 机体被感染后会启动免疫应答, 防御MTB的感染, 而巨噬细胞在这个过程中发挥重要作用, 是宿主抵御MTB感染的第一道防线, 被激活后可通过多种机制有效清除胞内的MTB。目前已证实巨噬细胞是MTB的关键靶细胞和宿主细胞, 同时也是抗MTB的主要效应细胞, 在MTB免疫逃逸过程起着极其重要的作用。因此, 阐明MTB逃逸机制, 将有助于为结核病预防和治疗找到新的策略和思路。

在MTB感染过程中, 活化的巨噬细胞可释放大量的炎症介质, 如TNF-α 、IL-1β 、IL-6和iNOS等从而发挥免疫调节作用, 进而刺激宿主产生抵抗MTB的免疫反应, 对MTB的杀灭和清除发挥十分重要的作用。由于炎症反应对MTB具有特别强的杀伤作用, MTB还能够释放多种毒力因子, 从而抑制巨噬细胞的炎症应答反应。炎症应答的另一个分支是诱导一氧化氮合酶(iNOS)的合成, 在巨噬细胞介导的宿主抵抗反应中起着十分重要的作用。感染的巨噬细胞内iNOS的活性随时间的延长而升高, 从而导致NOS的催化底物NO的含量增加。因此, iNOS可催化巨噬细胞中NO和活性氮介质的释放, 可激活巨噬细胞杀灭胞内细菌[1]。Chart等[2]研究报道, 活化的小鼠巨噬细胞产生的NO能够有效杀死致病的MTB。

MicroRNAs(miRNAs)是一类物种间高度保守的、非编码、长度为20~24 nt的单链小分子RNA, 可通过与靶基因mRNA 3'非编码区(3'-UTR)互补配对结合, 从而降解靶基因mRNA或者抑制其翻译, 进而在转录后水平负向调控靶基因的表达水平, 参与调控一系列生物进程。大量文献报道miRNAs广泛参与固有免疫及炎症应答的调控[3, 4]。越来越多研究发现MTB入侵巨噬细胞后, miRNAs表达量发生改变, 可通过靶基因调控炎症反应, 进而影响宿主细胞清除MTB[5, 6]。然而, 关于miR-506-3p的作用机制未见报道。基于上述研究, 本研究建立了稳定的BCG感染巨噬细胞模型, 着重探讨BCG感染后巨噬细胞中miR-506-3p表达水平的变化情况, 阐明在其中发挥的作用及可能的机制, 从而为深入探讨BCG与宿主细胞相互作用的分子免疫机制提供新的理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中科院上海细胞研究所; DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司, 美国); Trizol试剂及Lipofectamin2000转染试剂盒(Invitrogen公司, 美国); RT-PCR试剂盒(Qiagen公司, 德国); 反转录试剂盒及双荧光素酶检测试剂盒(Promega公司, 美国); BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司, 美国); PVDF膜(Millipore公司, 美国); SOCS-3和β -actin抗体(Abcam公司, 美国); ECL发光试剂(Thermo公司, 美国); TNF-α 、IL-1β 和IL-6酶联免疫试剂盒(RD公司, 美国); miR-506-3p模拟物(mimics)及阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养 RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中, 置于37 ℃, 5% CO2的培养条件下。每2~3 d更换1次培养液, 细胞密度适度时进行常规传代培养。

1.2.2 制备BCG感染巨噬细胞模型 将处于对数生长期的RAW264.7细胞, 用0.25%胰蛋白酶消化后, 细胞培养液吹打形成细胞悬液, 以2× 105 cells/孔接种于12孔板中, 培养16~24 h。按照感染复数为10∶ 1(细菌与巨噬细胞的比例为10∶ 1)加入细菌悬液, 对照组加入等体积的PBS培养基, 放在含CO2的37 ℃培养箱中孵育。感染4 h后, 以预温的PBS洗涤2次, 以清洗掉没有被巨噬细胞感染的细菌。之后加入新鲜的培养液继续培养, 并以此时作为细菌感染的零时。

1.2.3 实时荧光定量PCR TRIzol试剂盒抽提上述刺激条件下得到的RAW264.7细胞的总RNA, 应用分光光度计测定纯度。根据反转录试剂盒说明书的操作步骤将总RNA逆转录得到cDNA。应用SYBR Green PCR Kit试剂盒测定miR-506-3p的表达量及细胞因子TNF-α 、IL-1β 、IL-6和iNOS的mRNA表达水平。采用Quantity One凝胶成像分析系统测定各相应条带的灰度值, 以U6和β -actin分别作为miR-506-3p和目的基因的内参基因。

1.2.4 Western Blot检测蛋白表达 收集不同处理组的细胞, 经RIPA细胞裂解液获得各组细胞的总蛋白, 用BCA法测定蛋白浓度。取50 μ g细胞总蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离, 之后通过使用转膜仪将蛋白电转印至PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入稀释的特异性蛋白一抗, 置于4 ℃冰箱孵育过夜; 次日, 用PBST洗涤膜4次; 加入HRP标记的对应的二抗, 在室温条件下孵育1 h, PBST清洗膜3次; 增强化学发光试剂盒(ECL)曝光显色, 并拍照; 获得的蛋白条带采用凝胶成像分析系统Quantity One软件进行灰度值分析, 并计算目的蛋白与β -actin灰度值的比值。

1.2.5 ELISA检测细胞因子表达 分别收集不同处理组的细胞上清液, 采用ELISA方法分别检测细胞因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6分泌水平, 酶标仪在450 nm处测得OD值。所有操作步骤严格根据试剂盒说明规范进行。

1.2.6 一氧化氮(Nitric Oxide, NO)释放量检测 收集不同处理组的培养上清, 操作过程根据NO检测试剂盒使用说明进行。取200 L培养上清, 加入经室温平衡的100 L Griess Reagent R1, 再加入等体积Griess Reagent R2, 充分混匀后, 于室温条件下放置10 min, 酶标仪540 nm处测定各样品的吸光度。

1.2.7 CFU计数检测BCG存活率 巨噬细胞RAW264.7转染miR-506-3p mimics和Negative Control(NC)24 h, 被BCG刺激4 h后, 用PBS洗涤3次以清除细胞外细菌。此后, 被感染的细胞放置培养箱中在指定的时间内孵育。收集细胞裂解物, 并将稀释后的裂解物接种至含有OADC的Middlebrook 7H10琼脂平板上培养, 37 ℃培养箱中培养3周后, 进行菌落计数。

1.2.8 生物信息学预测 应用TargetScan 5.1, PicTar和miRanda等生物信息学在线分析软件进行预测获得miR-506-3p的靶基因。

1.2.9 双荧光素酶报告实验 分别将含有野生型(SOCS-3 3'-UTR-WT)和突变型(SOCS-3 3'-UTR-Mut)的报告基因载体、pRL-TK质粒、miR-506-3p mimics及其阴性对照NC分别共转染到RAW264.7细胞中, 转染48 h后, 操作步骤严格根据双荧光素酶检测试剂盒说明书进行, 并在酶标仪上分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因的活性。各组的相对荧光值以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度比值反映。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism5.0数据分析软件进行实验数据分析并作图, 计量数据以均数± 标准差( x¯± s)表示。两组数据间的比较使用t检验, 多组数据间的比较使用单因素方差分析。P< 0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 MiR-506-3p在BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中低表达

首先检测BCG感染的RAW264.7细胞中miR-506-3p表达量的变化情况, RT-PCR结果显示, RAW264.7细胞经BCG感染刺激后miR-506-3p的表达水平在BCG干预后的12 h, 24 h, 48 h逐渐下降, 并且随着处理时间的增加有明显的降低趋势(图1A), 说明BCG感染可引起RAW264.7细胞中miR-506-3p表达量下调。为深入探讨miR-506-3p在BCG感染巨噬细胞的免疫应答中的具体作用机制, 将其过表达, 转染效率如图1B所示, 细胞转染miR-506-3p mimics后, miR-506-3p的表达量显著升高。

图1 BCG感染的RAW264.7细胞中miR-506-3p表达量
A为RT-PCR检测miR-506-3p的mRNA表达量, 与0 h组相比, #P< 0.05; B为RT-PCR用于测定miR-506-3p过表达转染效率, 与NC组相比, * P为< 0.05。Fig.1 Expression of miR-506-3p in BCG-infected RAW264.7 cell

2.2 MiR-506-3p促进BCG感染的RAW264.7细胞中炎症因子生成

采用RT-PCR测定TNF-α 、IL-1β 和IL-6促炎细胞因子mRNA水平变化量。如图2A的结果所示, 在BCG感染和未感染的巨噬细胞RAW264.7中, miR-506-3p过表达组中细胞因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的mRNA表达水平显著高于NC组, 此结果表明miR-506-3p能够增加BCG刺激的巨噬细胞中TNF-α 、IL-1β 和IL-6的mRNA表达量。进一步用ELISA方法检测细胞因子分泌情况, 见图2B的结果, 在BCG感染和未感染的RAW264.7细胞中, miR-506-3p过表达组相较于NC组, 炎症介质TNF-α 、IL-1β 和IL-6的分泌水平明显升高, 与mRNA的表达趋势一致。上述结果提示miR-506-3p可正调控BCG感染所激发的炎症进程。

图2 MiR-506-3p对BCG感染的RAW264.7中炎症因子表达的影响
A为RT-PCR用于检测炎性细胞因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的mRNA表达量; B为ELISA用于检测炎性因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的蛋白表达量; 与NC组相比, * P< 0.05。Fig.2 Effects of miR-506-3p on the expression of inflammatory mediators in BCG-infected RAW264.7 cells

2.3 MiR-506-3p促进BCG感染后RAW264.7细胞中NO释放和iNOS表达

NO在抗感染等炎症应答中发挥重要介质作用。巨噬细胞吞噬病原体后随之活化, 并可通过NO相关途径杀灭胞内细菌, 进而观察miR-506-3p是否能够影响BCG激活的巨噬细胞NO释放。Griess法结果如图3A显示, 相比于NC组, miR-506-3p过表达后NO分泌量明显上升, 说明miR-506-3p可增加NO的释放。同时测定iNOS的mRNA相对表达量, 结果如图3B所示, 过表达miR-506-3p组iNOS表达量比NC组明显上升, 说明miR-506-3p能够上调iNOS的表达。

图3 MiR-506-3p对BCG感染的RAW264.7细胞中NO的释放和iNOS表达的影响
A为Griess法用于检测NO的产生量; B为RT-PCR检测iNOS的mRNA表达; 与NC组相比, * P< 0.05。Fig.3 Effects of miR-506-3p on NO production and iNOS expression in BCG-infected RAW264.7 cells

2.4 MiR-506-3p抑制RAW264.7细胞中BCG存活率

CFU结果显示, miR-506-3p过表达组与NC组相比, BCG的存活率明显下降(图4), 说明miR-506-3p可显著抑制胞内BCG存活率, 即有利于BCG的清除。

图4 MiR-506-3p对巨噬细胞RAW264.7中BCG存活率的影响
CFU用于测定胞内BCG存活率; 与NC组相比, * P< 0.05。Fig.4 Effects of miR-506-3p on BCG survival in RAW264.7 cells

2.5 MiR-506-3p靶向调控SOCS-3的表达

利用TargetScan 5.1、PicTar和miRanda等生物信息学在线软件预测miR-506-3p靶基因, 初步预测所得miR-506-3p可靶向结合SOCS-3的3'-UTR区(图5A)。进一步采用双荧光素酶活性实验验证预测结果, 结果发现, miR-506-3p可显著抑制SOCS-3 3'-UTR-WT的荧光素酶活性, 而对SOCS-3 3'-UTR-Mut荧光素酶活性无明显变化(图5B)。进而采用RT-PCR及Western Blot方法证实miR-506-3p对SOCS-3表达的影响, 结果显示过表达miR-506-3p后可显著降低SOCS-3的mRNA(图5C)和蛋白水平(图5D)。综上, miR-506-3p能够靶向结合SOCS-3的3'-UTR区并负调控其表达。

P< 0.05; 与Control组相比, #P< 0.05。
Fig.5 SOCS-3 is a direct target gene of miR-506-3p'>		图5 SOCS-3是miR-506-3p的直接靶基因
(A)生物信息学预测miR-506-3p靶向结合SOCS-3的3'-UTR区; (B)双荧光素酶报告实验评估荧光素酶活性; (C)RT-PCR用于检测SOCS-3的mRNA表达量; (D)Western Blot用于检测SOCS-3蛋白表达水平。与NC组相比, * P< 0.05; 与Control组相比, #P< 0.05。Fig.5 SOCS-3 is a direct target gene of miR-506-3p

3 讨论

MTB感染后, 巨噬细胞会通过许多信号通路激活自身, 导致释放大量炎症细胞因子, 从而提高机体的免疫杀伤功能, 促使巨噬细胞清除病原菌。TNF-α 作为一种重要的信号分子, 是触发炎症应答反应的主要炎症因子。IL-1β 和IL-6是引起机体炎症反应关键的细胞因子, 可在MTB感染后诱导保护性免疫应答, 在宿主免疫中发挥重要作用。有研究报道BCG感染能够诱导炎症因子IL-1β 和IL-6的表达[7]。本研究结果揭示, miR-506-3p过表达后可促进BCG刺激RAW264.7细胞中的炎症因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的分泌, 从而参与炎症反应调控进程。

巨噬细胞吞噬MTB后, 通过形成吞噬小体, 刺激细胞呼吸, 从而生产大量活性氮中间体, 而这些物质具有很强的细胞毒性, 增强对细菌的杀伤力。而活性氮的生成依赖于iNOS。NO是巨噬细胞通过氧依赖途径分泌生成的能直接杀灭MTB的重要分子[8]。RAW264.7细胞感染BCG后, miR-146a的表达量升高, 通过靶向作用于TRAF6抑制NF-κ B和MAPK通路的激活, 从而导致iNOS的表达和NO的产生降低, 促进巨噬细胞中MTB的存活[9]。巨噬细胞经MTB早期分泌蛋白ESAT-6处理后, let-7f的表达量下降, let-7f通过靶向作用于A20调控胞内活性氧与活性氮的表达量, 以避免毒性反应的发生, 从而使得胞内MTB存活率升高[5]。miR-155通过靶向调节C/EBPβ 的表达, 从而改变NOS2表达及NO的产生, 进而影响胞内MTB的生存能力[10]。因此, 通过检测过表达miR-506-3p后NO的释放情况, 以判断巨噬细胞的杀菌功能。结果揭示, miR-506-3p可显著增加BCG感染的巨噬细胞中NO的释放, 同时iNOS的表达水平上调。活化的巨噬细胞通过杀灭胞内细菌也是巨噬细胞抗MTB感染的重要途径之一。继而检测了巨噬细胞内BCG的存活率, 结果发现miR-506-3p过表达后胞内BCG的存活率降低。以上结果揭示miR-506-3p通过促进巨噬细胞的炎症进程从而抑制巨噬细胞的杀伤, 为找寻治疗结核分枝杆菌的潜在靶点提供了新的理论基础。

SOCS(Suppressor of cytokine signaling)家族是细胞因子信号传导通路的负性调节因子。SOCS-3通过调节许多免疫分子的信号, 从而参与各种炎症及自身免疫性疾病的发生发展。有研究发现SOCS-3在肺结核患者中高表达[11]; 另有研究表明BCG感染能够诱导巨噬细胞中SOCS-3高表达[12]。与前期研究结果一致, SOCS-3在BCG感染的RAW264.7细胞中明显上调, 且BCG刺激巨噬细胞诱导的SOCS-3和SOCS-1可抑制IFN-刺激的JAK/STAT信号通路[12]。SOCS-3高表达肺结核患者中Th1型细胞因子表达降低[13]。上述结果均已证实miR-506-3p在BCG感染激活的免疫应答中发挥了重要的调控作用, 显著促进BCG刺激引起的炎症应答反应, 增强了巨噬细胞的杀菌功能, 进而促进了BCG在巨噬细胞内的免疫清除。我们又继续阐明miR-506-3p引起炎症因子表达升高的具体调控机制。通过PicTar和TargetScan 5.1等miRNA靶基因预测软件发现SOCS-3可能是miR-506-3p的潜在靶点。利用荧光素酶报告实验进而证实miR-506-3p能够直接靶向调控SOCS-3的表达。RT-PCR和Western Blot进一步证实miR-506-3p负向调控靶基因SOCS-3的表达。由此表明miR-506-3p通过下调靶基因SOCS-3显著增加BCG活化的巨噬细胞释放促炎因子的能力及NO的分泌, 揭示miR-506-3p对BCG感染导致炎症的负性调控作用是通过抑制SOCS-3的表达实现的。

综上, miR-506-3p在BCG感染刺激巨噬细胞的炎症应答过程中发挥非常重要的调控作用, 可促进促炎因子的释放及NO的产生, 从而加剧巨噬细胞的杀伤作用, 进而抑制BCG在巨噬细胞内的存活和繁殖, 其可能作用的分子机制是通过负调控靶基因SOCS-3表达来实现的。MiR-506-3p在BCG感染的巨噬细胞中发挥的重要作用及其相关机制, 为研发新型结核疫苗及筛选抗结核药物靶点提供一定的理论依据。

利益冲突:无

引用本文格式:虞秀锋, 王启源, 姬文兰, 等.MiR-506-3p/SOCS-3促进BCG感染巨噬细胞引发的炎症应答反应[J].中国人兽共患病学报, 2020, 36(4):297-302. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.184

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