引用本文
杜阳阳, 张放, 苗智颖, 赵红, 马迪, 王静, 李淑英, 郑春阳, 李劲涛. 人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定[J]. 中国人兽共患病学报, 2020,36(4): 303-308
DU Yang-yang, ZHANG Fang, MIAO Zhi-ying, ZHAO Hong, MA Di, WANG Jing, LI Shu-ying, ZHENG Chun-yang, LI Jin-tao. Construction and identification of recombinant cytomegalovirus with human papillomavirus 58 E6E7 fusion gene[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2020,36(4): 303-308.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.046
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中国人兽共患病学报
人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定
杜阳阳1, 张放1, 苗智颖1, 赵红1, 马迪1, 王静1, 李淑英1, 郑春阳1, 李劲涛2
1.华北理工大学(河北省慢性疾病重点实验室,唐山市慢性病临床基础研究重点实验室),唐山 063210
2.北京工业大学,生命科学与生物工程学院,北京 100124;
李劲涛,Email:511046476@qq.com; ORCID:0000-0002-4597-8534
收稿日期: 2019-09-06
资助项目: 河北省留学人员科技活动资助项目(No. CY201620); 河北省卫计委项目(No. 20170896)
摘要
目的 利用人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)58突变型E6E7(Mutant type E6E7,mE6E7)融合基因为靶点,巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58 mE6E7融合基因的重组病毒,探讨HPV58mE6E7的转化活性。方法 PCR扩增带有50 bp Towne 开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的GalK、mE6E7及野生型E6E7(Wild type E6E7,wE6E7)融合基因片段,切胶回收纯化;将GalK片段电转到(SW102-T-BAC)感受态细胞,经过同源重组、GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-Galk-BAC克隆;然后分别将纯化的mE6E7及wE6E7电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,经脱GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC克隆;提取所得克隆质粒DNA,转染ARPE-19细胞(以转染SW102-T-BAC的细胞及未转染细胞为对照),逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达状况;观察重组病毒T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析mE6E7及wE6E7转化活性。结果 获得了SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象,其形态由原来梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多;并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC、SW102-T-BAC及未转染细胞未出现上述细胞的特点。结论 获得了T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7重组病毒,并且重组病毒T-ORF75-mE6E7的转化活性已消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。
关键词: 人乳头瘤病毒; E6E7融合基因; 细菌人工染色体; 同源重组; 巨细胞病毒
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2020)04-0303-06
Construction and identification of recombinant cytomegalovirus with human papillomavirus 58 E6E7 fusion gene
DU Yang-yang1, ZHANG Fang1, MIAO Zhi-ying1, ZHAO Hong1, MA Di1, WANG Jing1, LI Shu-ying1, ZHENG Chun-yang1, LI Jin-tao2
1. North China University of Science and Technology/Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, Tangshan 063210,China
2.College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124,China
Li Jin-tao, Email:511046476@qq.com; ORCID:0000-0002-4597-8534
Abstract
To investigate the conversion activity of Human papillomavirus58 mutant E6E7 fusion gene (HPV58 mE6E7) and establish Towne recombinant virus carrying HPV58 mE6E7 fusion gene, which used HPV58 mE6E7 as target and Towne cytomegalovirus bacterial artificial chromosome (SW102-T-BAC) as a vector. The GalK, mE6E7 and Wild type E6E7 (wE6E7) gene fragments with about 50 bp Towne ORF75 homologous arms were amplified and purified. GalK was transferred to the competent cells of SW102-T-BAC. The clones of SW102-T-ORF75-GalK-BAC were obtained by homologous recombination, the selection from containing GalK and chloramphenicol medium. The fragments of mE6E7 and wE6E7 were transferred to the competent cells of SW102-T-ORF75-GalK-BAC. The clones of SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC and SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC were obtained by homologous recombination, the selection from replaced GalK and chloramphenicol medium, respectively. The plasmids of SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC and SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC were extracted, and transfected into ARPE-19 cells (ARPE-19 cells transfected with SW102-T-BAC and untransfected used as control). The expression of mE6E7 and wE6E7 in transfected cells were verified by reverse transcription PCR and sequencing. The effect of T-ORF75-mE6E7 and T-ORF75-wE6E7 on ARPE-19 cells were observed. The transformation activity of mE6E7 and wE6E7 were analyzed by soft agar cloning. The clones of SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC and SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC were obtained. The expression of mE6E7 and wE6E7 in transfected cells were verified by reverse transcription PCR and sequencing. ARPE-19 cells of transfected SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC grow overlapping and lost contact inhibition, and the morphology of the cells changed from the original long fusiform to round, swelling, and full of cytoplasm particles, the cells can form clones in soft agar. The cells of transfected SW102-T-ORF-mE6E7-BAC, SW102-T-BAC, and untransfected do not show those characteristics of transfected SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC cells. The recombinant virus of T-ORF75-mE6E7 and T-ORF75-wE6E7 were obtained, and the transformation activity of recombinant virus of T-ORF75-mE6E7 has been eliminated, which provided a foundation for the research of HPV58 therapeutic vaccine.
Key words: human papillomavirus; E6E7 fusion gene; bacterial artificial chromosome (BAC); homologous recombination; cytomegalovirus

宫颈癌发病率在世界范围内居女性恶性肿瘤的第二位, 是危及全球妇女健康的严重疾病, 据国际癌症中心(IARC)估计, 全球每年宫颈癌新发病例数约52.8万, 死亡人数约26.6万[1]。研究证明, 人乳头状瘤病毒 (human papillomavirus, HPV) 中13种高危型长期反复感染是宫颈癌发生的必要条件[2, 3, 4]; 有研究表明HPV 58型在我国感染率较高[5, 6]。尽管Gardasil 9 (HPV9价疫苗)已经在世界范围内上市, 该疫苗可预防9型HPV所致某些疾病(包括HPV型16, 18, 31, 33, 45, 52和58型所致宫颈癌、外阴癌、阴道癌和肛门癌, 以及HPV 6或11型所致尖锐湿疣)[7, 8], 然而这种疫苗只适用于没有感染过HPV的人群, 对于已经感染上述相应型别HPV而导致的病变患者没有作用, 因此, 研制HPV58型治疗性疫苗是非常必要的。依据上述事实和原理, 本项研究以HPV58突变型E6E7(Mutant type E6E7, mE6E7)融合基因为靶点, 用HPV58野生型E6E7(Wild type E6E7, wE6E7)融合基因片段作对照, 利用对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome, SW102-T-BAC)为载体, 构建携带HPV58 mE6E7及wE6E7融合基因的重组巨细胞病毒, 探讨HPV58mE6E7的转化活性, 为HPV58型治疗性疫苗研制奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料

GalK质粒(pGalK), 对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome, SW102-T-BAC)包含巨细胞病毒的全基因组, 并带有氯霉素抗性基因, 为美国罗格斯大学, 新泽西医学院朱桦教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 HPV58 E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 HPV E6和E7基因特有的Cys-x-x-Cys基序具有锌指结构与抑癌基因p53, Rb结合并降解抑癌基因。为消除E6, E7基因可能的恶性转化活性, 将锌指结构进行突变[9, 10], 构建E6E7突变型融合基因。根据GenBank提供的基因编码区序列, 对野生型基因序列加以改造, 同时将E7与E6之间的终止子进行改造, 使其形成连续编码序列, 而形成融合基因(具体改造方法见图1), 这样mE6E7融合基因保证了读码框的正确性, 既可消除E6与E7的转化活性又能保留其抗原性。委托北京赛思莱博科技有限公司合成突变型E6E7(mE6E7)与野生型E6E7(wE6E7)融合基因。

1.2.2 带有T-ORF75左/右同源臂GalK、HPV58 wE6E7与mE6E7融合基因引物的设计及片段扩增

1)依据GenBank提供的Towne株(FJ616285.1)基因序列, 分别设计其开放读码框ORF75(Towne-ORF75左/右同源臂GalK, HPV58 E6E7融合基因引物(见表1)。委托北京赛思莱博科技有限公司引物合成。2)用所设计引物, 以质粒GalK、HPV58 wE6E7及mE6E7融合基因片段为模板, 分别扩增GalK片断、野生型及突变型融合基因wE6E7与mE6E7片段, 反应体系 (100 μ L):PCR mix包括Buffer、dNTP Mixture及Taq DNA polymerase, primers 10 μ mol/L (表1 GalK Primers及HPV58 E6E7 Primers), 和 200 ng GalK质粒DNA。 PCR反应循环:95 ℃/15 min; 31个循环95 ℃/30 s; 55 ℃/30 s; 72 ℃/1.5 min; 延伸72 ℃/10 min, 4 ℃储存。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 并切胶纯化回收。

2 结 果
2.1 HPV58 E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成将HPV58 E6蛋白降解P53的活性部位、E7蛋白与pRB结合位点关键氨基酸改造后, 所得片段基因序列如图1。
图1 HPV58 E6E7野生型与突变型融合基因突变位点序列Fig.1 HPV58 E6E7 fusion gene sequence of Wild-type and Mutant type

2.2 GalK插入SW102-T-ORF75-BAC

GalK培养基中培养3 d后, 选取其中3个菌落, 提取质粒DNA, 以3个菌落质粒DNA为模板PCR扩增, 检测到大小为 1 550 bp的PCR产物(图2), 所得产物大小与预期结果相一致, 表明GalK已克隆至Towne细菌人工染色体的开放读码框75, 将正确克隆命名为SW102-T-ORF75-GalK-BAC。

图2 GalK克隆到SW102-T-ORF75-BAC后PCR扩增检测结果
M为1kb plus DNA ladder, 1为阴性对照, 2-4为GalK插入SW102-T-ORF75-BAC后, 所选取的GalK培养基中生长的3个克隆, 以所选的3个克隆质粒DNA为模板, PCR产物电泳的结果。Fig.2 Results of PCR amplification for detection GalK cloned to SW102-T-ORF75-BAC

2.3 HPV58E6E7融合基因代替galK基因

经过脱GalK培养基培养后, 分别选取2个菌落, 检测到大小为1 012 bp的PCR扩增产物(图3), 所检测到的片段与预期结果一致, 证实HPV58 wE6E7与mE6E7分别克隆至SW102-T-ORF75-GalK-BAC。正确克隆命名为SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC, SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC。

图3 HPV58 mE6E7与wE6E7插入SW102-T-ORF75-GalK-BAC替代GalK所选克隆PCR扩增后电泳结果
M为1kb plus DNA ladder, 1是阴性对照, 2-3 :HPV58-mE6E7替代GalK所选2个克隆PCR扩增后电泳结果, 4-5:HPV58 wE6E7替代GalK所选2个克隆PCR扩增后电泳结果。
Results of PCR amplification for verification galk replaced by HPV58-mE6E7与wE6E7 in SW102-T-ORF75-GalK-BAC

2.4 转染与未转染细胞生长状况

分别将 SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC质粒转染ARPE-19细胞, 培养10 d 后, 在倒置显微镜下观察, 转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制, 出现重叠生长现象, 其形态由原来长梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多(图4)。

图4 转染ARPE-19细胞生长状况(倒置显微镜下观察结果
× 200) A为未转染细胞; B为转染SW102-T-BAC至ARPE-19的细胞; C为转染SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC至ARPE-19的细胞; D为转染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC至ARPE-19的细胞。Fig.4 Growth of ARPE-19 cells were transfected (The results were observed under an inverted microscope × 200)

2.5 转染与未转染细胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7表达状况

第20 d 收集转染后细胞, 分别提取各组细胞RNA, 逆转录PCR检测T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7 表达状况, 逆转录PCR检测到转约250 bp、1 012 bp及1 012 bp PCR产物, 分别为转染SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的结果(图 5)。 测序分析表明HPV58-mE6E7与HPV58-wE6E7稳定表达于转染的细胞中。

图5 细胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7与T-ORF75-HPV58-wE6E7逆转录PCR检测结果
M为1kb plus DNA ladder, 1:将SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC转染 ARPE-19细胞, 培养后提取细胞RNA, 逆转录PCR扩增产物电泳的结果; 2:将SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC 转染 ARPE-19细胞, 培养后提取细胞RNA, 逆转录PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果; 3:用SW102-T-BAC转染细胞ARPE-19, 将转染的细胞培养后提取RNA, 然后逆转录PCR扩增产物电泳的结果, 4:将未转染细胞提取的RNA, 进行逆转录PCR扩增, 其产物电泳的结果; 5:是阴性对照。Fig.5 Results of reverse transcription PCR of T-ORF75-HPV58-mE6E7 and T-ORF75-HPV58-wE6E7 in transfected cells

2.6 软琼脂克隆实验

以分裂3次增殖8个细胞作为一个克隆, 培养至第6 d, 在倒置显微镜下可观察到稳定表达T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的细胞组有克隆形成, 而稳定表达T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、T-BAC及未转染的ARPE-19细胞未见克隆形成; 培养至12 d, 克隆明显增多增大, 细胞呈堆积生长(图6), 克隆形成率为23.5%(47/200)。稳定表达T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、 T-BAC、及未转染的ARPE-19细胞组未见有克隆形成。

图6 转染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7的ARPE-19细胞在软琼脂中形成的典型克隆(× 200)Fig.6 Clone of ARPE-19 cells were transfected with SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7 in soft AGAR(× 200)

3 讨 论

虽然世界范围内已有HPV预防性疫苗上市[8, 12], 预防HPV疫苗可保护健康人群免患相应型别HPV感染所导致的疾病, 但对已感染相应HPV型别患病的人群没有治疗的效果, 对已感染各型别HPV导致的各类疾病, 还需相应的治疗性疫苗。目前治疗性HPV疫苗还处于研发阶段, 理想治疗性HPV疫苗既要在患者体内产生强的细胞免疫, 又要清除患者体内已感染的HPV, 同时还要在患者体内产生中和抗体, 中和患者体内病毒, 而抑制病毒的传播。

高危型HPV感染的恶性肿瘤中, E7与E6蛋白是形成HPV相关恶性肿瘤及维持其恶性表型所必需的蛋白; E6通过降解P53, 降低细胞对DNA合成修复能力, 容易出现错误的基因结构; E7与pRb基因结合, 诱导中心体合成异常增多, 使得有丝分裂异常紊乱, 非整倍体细胞出现, 从而导致细胞的恶性转化[13, 14]。E6和E7两个癌基因在HPV阳性恶性肿瘤细胞中持续表达, 而在正常细胞中不表达, 因此, E6和E7蛋白属于肿瘤细胞中特异性的病毒抗原, 是HPV阳性肿瘤免疫治疗的理想靶抗原, 可将HPV E6和E7基因加以改造研制成治疗性疫苗; 但如果用野生型E7与E6基因直接作抗原, 构建E6E7融合基因, 有潜在致癌性; 因此, 需将野生型E7基因与pRB基因结合位点加以改造, E6降解P53基因位点加以改造, 使其发生突变, 敲除E7与E6基因的转化活性, 并将E7与E6各自的终止密码子加以改造, 这样所构建的突变型融合基因, 既保留了其抗原性, 又去除了其致癌性, 同时, 也保证了融合基因读码框的正确性。因此, 本项研究将E6基因结合p53、E7结合Rb活性部位锌指结构域内一些氨基酸序列加以改变, 消除E6结合p53、E7结合Rb基因的降解活性, 即E6第50位的亮氨酸在高危HPV中高度保守, 可能在E6转化过程中起重要作用; 第63位和第106位的半胱氨酸位于E6的一对锌指结构的两侧, 在对p53的结合中起重要作用。E7中第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸位于一对锌指结构的两侧, 第92位半胱氨酸位于一个独立的锌指结构中[10], 因此, 我们将这些部位碱基序列加以改变, 消除E6终止密码子, 并保证E6与E7读码框的正确性, 使其形成融合基因, 分别构建了HPV58mE6E7和HPV58wE6E7融合基因的重组病毒。通过转染细胞形态学观察及软琼脂克隆实验证实所构建的重组病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7已消除致癌活性。

表1 本项实验中所需引物名称、序列及大小Tab.1 the name, sequence and size of the primers required in this experiment
引物名称序列产物大小/bp
Galk Primers
GalK ForwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaacccagcggcgcggccgcgctatgCCTGTTGAC-AATTAATCATCGGCA
GalK Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg-TCAGCACTGTCCTGCTCCTT1 400
HPV58E6E7 Primers
HPV58E6E7 ForwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaacccagcggcgcggccgcgctatgATGTTCCAGGACGCAGAGGAG
HPV58E6E7 Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg TCCTTGCTG-
TGCACA GCTAG		861
Galk Check Primers
Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag
Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 550
HPV58E6E7 check Primers
Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag
Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 012
1.2.3 将已纯化的Galk片段插入Towne开放读码框75(T-ORF75) 将上述纯化的GalK片段电转到SW102-T-BAC感受态细胞, 然后用1 mL LB培养液, 于32 ℃振摇1 h后, 离心, 再用1× M9液洗涤沉淀物2次, 将洗涤后的菌均匀涂布于M63配制的含有Galk的培养基[7], 在32 ℃培养3 d后长出细菌克隆; 挑选3个克隆, 提取质粒DNA, PCR检测GalK(表1 GalK Check Primers)。检测正确克隆质粒命名为SW102-T-ORF75-GalK-BAC。并制备其电转感受态细胞, 负80 ℃储存备用。
1.2.4 HPV58E6E7融合基因代替GalK基因 取约800 ng已纯化的T-ORF75左/右同源臂HPV58 wE6E7与mE6E7融合基因片段, 分别电转化到SW102-T-ORF75-GalK-BAC感受态细胞, 用1 mL LB培养液, 于32 ℃振摇4 h 30 min, 离心, 再用1× M9液洗涤细菌沉淀物2次, 将细菌沉淀物混悬于1 mL M9洗涤液后, 分别在进行10倍及100倍稀释后, 用不同浓度的稀释菌液涂布于脱GalK培养基[11], 32 ℃培养3 d, 有克隆形成; 分别选2个克隆, 提取质粒DNA, PCR检测(表1 HPV58E6E7 Check Primers), 正确克隆命名为SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC, SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC。
1.2.5 转染 ARPE-19细胞接种于12孔细胞培养板, 常规培养, 待ARPE-19细胞生长到汇合度为60%时, 用脂质体介导分别将SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC质粒转染ARPE-19细胞, 每种质粒转染3个复孔, 剩余培养板中的3个孔细胞作为对照。24 h后将细胞培养液更换; 并且每天观察细胞生长状况。待细胞长满各孔后, 转移到培养皿(直径为10 cm)继续培养。
1.2.6 转染细胞中HPV58 mE6E7与wE6E7表达状况 待10 cm培养皿中细胞完全汇合后, 收集各组细胞, 分别提取各组细胞RNA, 逆转录PCR扩增检测所收集细胞中HPV58 mE6E7与wE6E7的表达, 并将PCR产物测序分析。
1.2.7 软琼脂克隆实验 底层软琼脂制备:配制1.5%琼脂10 mL高压灭菌, 待其冷却至大约50 ℃, 加入2XDMEM 10 mL, 混均, 于24孔板的每个孔中加入0.8 mL, 于室温使其凝固。
上层琼脂制备:将10 mL已灭菌含0.7%琼脂冷却至大约50 ℃, 迅速加入10 mL含20%血清的2XDMEM培养液和稳定表达SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC与SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC及未转染的ARPE-19对数生长期细胞(浓度为3× 103个/mL), 混匀, 浇入底层铺有软琼脂的24孔培养板中, 每组细胞接种6个复孔, 琼脂凝固后将培养板放置在5% CO2、温度为37 ℃及饱和湿度环境下培养12 d。每天在倒置显微镜下观察软琼脂中细胞克隆形成情况, 并记录克隆形成数量, 以分裂3次增殖8个细胞作为1个克隆, 计算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)× 100%。
2 结 果
2.1 HPV58 E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成将HPV58 E6蛋白降解P53的活性部位、E7蛋白与pRB结合位点关键氨基酸改造后, 所得片段基因序列如图1。
图1 HPV58 E6E7野生型与突变型融合基因突变位点序列Fig.1 HPV58 E6E7 fusion gene sequence of Wild-type and Mutant type

2.2 GalK插入SW102-T-ORF75-BAC

GalK培养基中培养3 d后, 选取其中3个菌落, 提取质粒DNA, 以3个菌落质粒DNA为模板PCR扩增, 检测到大小为 1 550 bp的PCR产物(图2), 所得产物大小与预期结果相一致, 表明GalK已克隆至Towne细菌人工染色体的开放读码框75, 将正确克隆命名为SW102-T-ORF75-GalK-BAC。

图2 GalK克隆到SW102-T-ORF75-BAC后PCR扩增检测结果
M为1kb plus DNA ladder, 1为阴性对照, 2-4为GalK插入SW102-T-ORF75-BAC后, 所选取的GalK培养基中生长的3个克隆, 以所选的3个克隆质粒DNA为模板, PCR产物电泳的结果。Fig.2 Results of PCR amplification for detection GalK cloned to SW102-T-ORF75-BAC

2.3 HPV58E6E7融合基因代替galK基因

经过脱GalK培养基培养后, 分别选取2个菌落, 检测到大小为1 012 bp的PCR扩增产物(图3), 所检测到的片段与预期结果一致, 证实HPV58 wE6E7与mE6E7分别克隆至SW102-T-ORF75-GalK-BAC。正确克隆命名为SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC, SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC。