本研究涉及的所有实验内容均征得CE患者和对照人群的知情同意, 研究已通过新疆医科大学第一附属医院伦理学委员会批准。研究对象由CE患者和对照人群组成。CE患者30例, 为2017年1月至2017年12月在新疆医科大学第一附属医院消化血管外科中心肝胆包虫外科住院的确诊患者(根据B超分型, 均为活动性CE1-CE3患者), 其中男性18例, 女性12例, 平均年龄44± 13.42岁。CE患者经临床表现及体征、免疫学检查、B超和CT检查进行确诊, 所有患者均为初次手术, 且无慢性感染病、先天性肝囊肿、胆囊积液等其他肝胆系统疾病; 对照组30例为体检人群, 其中男性16例, 女性14例, 平均年龄41± 10.21岁, 均排除慢性感染、右侧肾盂积水、细菌性肝脓肿、先天性肝囊肿、胆囊积液、先天性胆总管囊型扩张症等肝胆系统疾病及其他重大疾病。

1.1.1 标本采集 30例CE患者和30例对照人群均空腹8 h后采集EDTA抗凝血5 mL和不抗凝血3 mL。EDTA抗凝血为FCM检测和QRT-PCR检测用。不抗凝血经3 000 r/min 离心5 min(德国eppendorf -5415R), 吸取血清于EP管中, -20 ℃冻存待ELISA检测用。

1.2.1 FCM法检测外周血PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞的百分比 将30例CE患者和30例对照人群的外周血放置于流式管中, 裂解红细胞, 制备单细胞悬液, 用台盼蓝染色计活细胞数> 95%, 分别加入流式抗体(美国BD公司)CD3-APC 2 μ L、CD4-Percp 2 μ L、PD-1-PE 2 μ L、CD25-Pecy7 2 μ L, 室温避光孵育20 min后, 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次, 用PBS重悬细胞, 调整细胞数为2× 10⁶/mL, 用流式细胞仪(德国美天旎生物技术有限公司)检测。

1.2.2 QRT-RCP法检测外周血PBMCs中PD-1 mRNA和Foxp3 mRNA的含量。

1.2.2.1 设计引物 从GenBank获取人PD-1和Foxp3基因全序列, 用VectorNTIsulte7.0软件包对获取的人的各基因序列进行比对分析, 选取相对保守、同源性高的区域应用Primer5.0进行引物设计, 以β -actin作内参照(表1)。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 PD-1、Foxp3和β -actin基因引物序列 Tab.1 Gene primers sequence of PD-1、Foxp3and β -actin Gene primer PCR product(5'-3') size/bp PD-1 F:GGACTATGGGGAGCTGGATT 110 R:CCATTCCGCTAGGAAAGACA Foxp3 F:CTGACCAAGGCT TCATCTGTG 176 R:ACTCTGGGAATGTGC TGTTTC β -actin F:GCCGATCCACACGGAGTACT 101 R:TTGCCGACAGGATGCAGAA

表1 PD-1、Foxp3和β -actin基因引物序列 Tab.1 Gene primers sequence of PD-1、Foxp3and β -actin

1.2.2.2 人全血DNA的提取 所有用品均严格按消除RNase的常规方法处理, 玻璃及金属器皿在250 ℃烘烤4 h, 塑料器皿用DEPC溶液浸泡24 h, 高压灭活DEPC后烤干备用。采集CE患者和对照人群外周血, 分离外周血PBMCs并保存于液氮中作进一步分析。用Trizol-LS试剂(Invitrogen, Life Technologies, 美国)从PBMCs中提取总RNA, 用M-MLV逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, 美国)反转录成cDNA。提取的cDNA用Smartspec3000型紫外分光光度计测定浓度和纯度。

1.2.2.3 目的基因检测 采用SYBR-GREEN-PCR预混料(中国大连TaKaRa生物技术有限公司)按照制造商的方案进行QRT-PCR(美国BIO-RAD公司)。扩增目的基因和内参基因β -actin。反应条件:50 ℃ 2 min(UDG孵育), 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环。用2^{-Δ Ct}对靶基因进行Ct值量化。重复实验至少3次。

1.2.3 ELISA法检测血清中TGF-β 和IL-10的水平 检测CE患者和对照人群血清中TGF-β 和IL-10的水平。检测按照ELISA试剂盒说明书进行操作, 酶标仪(美国BIO-RAD公司)450 nm处读吸光度(OD)值, 根据标准曲线计算浓度。

所有数据采用Excel和 Graphad Prism 6.0软件进行作图和统计分析。计量资料以$\bar{x}$± s 表示, 两组均数间比较采用独立样本t检验, 相关分析采用Pearson相关分析。P< 0.05表示差异有统计学意义。

通过流式细胞术检测CE患者和对照人群中PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表达分别为(34.03± 5.97)%和(12.82± 3.92)%; 与对照人群相比, CE患者PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞(P=0.000)的表达均增高(图1)。

图1

Fig.1

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	图1 外周血中PD-1+CD4+CD25+ Treg细胞的比例 注:①P< 0.001Fig.1 Ratio of PD-1+CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood

通过荧光定量PCR检测CE患者和对照人群中PD-1 mRNA含量的表达分别为4.79± 0.95和1.03± 0.4; Foxp3 mRNA含量的表达分别为17.92± 2.66和8.36± 2.29。与对照人群相比, CE患者中PD-1(t=18.35, P=0.000)和Foxp3 mRNA(t=14.89, P=0.000)含量均显著增高(P< 0.01)(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 外周血单个核细胞中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表达 注:①P< 0.001Fig.2 The mRNA expression of PD-1 and Foxp3in peripheral blood mononuclear cells

通过ELISA法检测CE患者和对照人群血清中TGF-β 水平的表达分别为15.10± 2.35和9.76± 1.53; IL-10水平的表达分别为19.81± 3.36和10.02± 2.31。与对照人群相比, CE患者TGF-β (t=10.43, P=0.046)和IL-10(t=13.13, P=0.000)水平的表达均增加(P< 0.05)(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 血清中TGF-β 和 IL-10水平的表达 注:a)The levels of TGF-β in sera; b) The levels of IL-10 in seraFig.3 Levels of TGF-β and IL-10 in sera

2.4.1 CE患者外周血中PD-1和Foxp3 mRNA含量的表达的相关性 通过Pearson法分析CE患者外周血中PD-1mRNA及Treg细胞转录因子Foxp3 mRNA表达的相关性发现, CE患者外周血PD-1 mRNA的表达均与Foxp3 mRNA表达水平呈正相关(r=0.602, P< 0.01)(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 PD-1 mRNA与Foxp3mRNA的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of PD-1 mRNA and Foxp3 mRNA

2.4.2 CE患者外周血中PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞与血清中TGF-β 和IL-10水平的相关性 通 过Pearson法分析CE患者外周血中PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞的表达及血清中TGF-β 和IL-10的相关性发现, CE患者外周血中PD-1⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞与TGF-β (r=0.477, P< 0.01)和 IL-10(r=0.825, P< 0.01)的水平均呈正相关(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 外周血中PD-1+CD4+CD25+Treg细胞和TGF-β 、IL-10水平的表达的相关性 注:a) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β ; b) The correlation analysis between PD-1+CD4+CD25+Treg cells and IL-10Fig.5 Correlation analysis of PD-1+CD4+CD25+Treg cells and TGF-β 、IL-10