实验菌株来源于中国疾病预防控制中心传染病所结核病室菌株库。23个菌株中包括19株结核分枝杆菌和4株临床常见非结核分枝杆菌标准菌株(快生型非结分枝杆菌鸟结核分枝杆菌ATCC25291、胞内分枝杆菌ATCC13950; 慢生型非结分枝杆菌马赛分枝杆菌DSM45103; 脓肿分枝杆菌ATCC19977)。药敏试验中的18个结核分枝杆菌按耐药类型分为2株全敏菌株(含标准菌株H37Rv)、4株异烟肼单耐药菌株、4株利福平单耐药菌株、4株耐多药(Multidrug-resistant, MDR)菌株和4株泛耐药(Extensively drug-resistant, XDR)菌株。除标准菌株外, 均为我国临床分离菌株。

抗结核药物购自美国Sigma公司; Middle brook 7H9 Agar、Mueller-Hinton Agar 和增菌液OADC购自BD公司; 二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司、Alarmar Blue 购自BIO-RAD公司; 改良固体罗氏培养基购自珠海银科医学工程股份有限公司; 薄层硅胶板 GF254、200-300目硅胶为中国青岛海洋化工集团公司产品; 石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、碘化铋钾等为国产分析纯试剂。

1.3.1 独山瓜馥木提取物的分离制备

1.3.1.1 前处理 独山瓜馥木根采自贵州省独山县, 经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定。手工分拣、漂洗切块后, 自然干燥, 粉碎。

1.3.1.2 一次提取 10 kg原药材, 以6倍体积80%的乙醇, 分批次回流提取; 旋转蒸发仪(37 ℃)减压蒸馏回收乙醇提取液, 50 ℃水浴浓缩蒸干。以10%的乙醇再溶解提取物后, 分别用1.5 倍体积的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷对提取物多次萃取至无色, 旋蒸萃取液, 得到3种一次萃取物。

1.3.1.3 活性跟踪 将一次萃取物溶解, 与罗氏培养基混合, 制备成浓度为80 μ g/mL的含药培养基; 取3~4滴结核分枝杆菌BCG菌株(麦氏浊度1.0)的新鲜培养物接种至含药罗氏培养基斜面, 37 ℃培养2~3周。菌落数≤ 5个视为有效。

1.3.1.4 二氯甲烷提取物定性分析 将萃取出的二氯甲烷层点板进行薄层层析, 二氯甲烷/甲醇(20/1)为展开剂展开完全后, 用碘化铋钾显色剂均匀喷洒薄层。

1.3.1.5 二次提取 对1.3.1.2中获得的二氯甲烷萃取物(组分1)进行二次分离纯化。200-300目硅胶柱, 石油醚∶ 乙酸乙酯(7∶ 3)洗脱分离生物碱类成分, 得到组分2; 甲醇冲洗硅胶柱, 冲洗液过大孔树脂, 以50%乙醇为流动相分离苷类或者黄酮类成分, 得到组分3。

1.3.2 体外药物敏感试验

1.3.2.1 菌液制备 分枝杆菌新鲜培养物, 超声分散。结核分枝杆菌至麦氏浊度1.0, 取400 μ L菌液加入7.60 mL 的7H9 (10% OADC)培养基中, 制成8 mL菌液备用; 非结分枝杆菌至麦氏浊度0.5, 取20 μ L菌液加入7.98 mL MH (10%OADC)中, 制成8 mL菌液备用(快生型非结不加OADC)。

1.3.2.2 药液制备 药物用适宜的溶剂(水或DMSO)配制成51.2 mg/mL的储存液, 再用相应的液体培养基2× 倍比稀释成梯度浓度。实验药物的浓度范围为40~320 μ g/mL, 对照质控药物异烟肼和利福平为0.125~64 μ g/mL, 卡那霉素为1~128 μ g/mL。

1.3.2.3 药敏检测 取PCR8联管, 每孔中加入相应备用菌液100 μ L后, 实验药物组再加入100 μ L梯度药液, 生长对照组再加入100 μ L无药物的培养基。37 ℃培养。快生型非结在培养的第2 d, 结核和慢长型非结在培养的第6 d开始在生长对照组的第一孔中加入70 μ L Alarmar Blue显色剂, 24 h之后观察变色情况。如显色液从蓝色变成紫红色或粉色, 说明细菌已经生长, 则在该菌株的实验药物组中每孔加入70 μ L显色液。若生长孔未出现颜色变化, 则依次每日在生长对照孔中添加显色剂, 直至变色为止。最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)定义为实验药物组中显色剂颜色完全没有发生改变(即仍为蓝色)的最小药物浓度。每个菌株设3个重复, 整体药敏试验重复2次。

10 kg原药材经乙醇提取后获得600 g提取物。一次提取分别获得80 g石油醚层、120 g乙酸乙酯层和120 g二氯甲烷层萃取物, 其中二氯甲烷萃取物在活性跟踪实验中的菌落数是3个, 显示其具有抗结核活性。二氯甲烷萃取物经薄层层析和碘化铋钾显色后出现橙红色斑点, 说明二氯甲烷萃取物中为总生物碱类物质。二次提取分离, 获得9.3 g组分2和20.2 g组分3。

中药相对毒性低, 用量可以稍大, 因此在本次实验中设置了40、80、120、160、200、240、280和320 μ g/mL 8个浓度梯度。药敏实验结果显示(表1), 3种组分对非结分枝杆菌的MIC值都很高, 在200 μ g/mL以上, 没有很好的抑菌效果。3种组分对结核分枝杆菌的MIC值明显低于非结分枝杆菌, 都有一定程度的抑制作用, 抑菌效果依次为组分2> 组分1> 组分3。值得注意的是, 3个组分对耐药株, 无论是单药耐药株, 还是MDR菌株的抑制效果都优于全敏感菌株。尤其是组分2, 其对43.75%(7/16)的耐药株的MIC值低于最小检测浓度。虽然组分3对3个菌株的MIC值为40 μ g/mL, 但可以看出它的抑菌效果比组分1差, 因此在二氯甲烷萃取的基础上进行石油醚/乙酸乙酯萃取能进一步提纯抗结核有效成分, 而50%乙醇的洗脱无效。

表1

Tab.1

表1(Tab.1)

表1 独山瓜馥木根提取物3个组分药敏试验结果 Tab.1 MIC of three extracted components of Fissistigma cavaleriei root 种属 菌株号 菌株类型 MIC (μ g/mL) 组分1 组分2 组分3 结核分枝杆菌 H37Rv 全敏感 160 160 80 80 ≥ 320 ≥ 320 FJ05060 240 240 160 160 ≥ 320 ≥ 320 FJ05005 单耐异烟肼 160 120 160 160 ≥ 320 ≥ 320 FJ05124 ≤ 40 ≤ 40 200 200 ≥ 320 ≥ 320 HeN05007 80 80 ≤ 40 ≤ 40 ≥ 320 ≥ 320 HeN05020 120 80 ≤ 40 ≤ 40 80 ≤ 40 FJ14018 单耐利福平 80 80 120 80 80 80 FJ14049 ≤ 40 80 40 40 ≥ 320 ≥ 320 HeN05030 120 120 160 160 ≥ 320 ≥ 320 HN04076 80 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 120 120 T2 MDR ≤ 40 ≤ 40 120 120 ≥ 320 ≥ 320 T4 80 80 200 160 ≥ 320 ≥ 320 SC06162 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 160 160 FJ14050 80 80 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 T5 XDR 120 120 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 ≤ 40 FJ14057 200 160 160 160 240 240 FJ09143 280 280 120 120 ≥ 320 ≥ 320 FJ14056 80 80 160 120 ≥ 320 ≥ 320 非结分枝杆菌 DSM45103 快生型 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ATCC19977 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ATCC25291 慢生型 200 200 240 240 ≥ 320 ≥ 320 ATCC13950 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 ≥ 320 注:组分1为二氯甲烷层萃取物、组分2为石油醚/乙酸乙酯萃取物、组分3为50%EtOH洗脱层。

表1 独山瓜馥木根提取物3个组分药敏试验结果 Tab.1 MIC of three extracted components of Fissistigma cavaleriei root