冠状病毒科下分α 、β 、γ 和δ 4个属, 病原学调查确认病原体为一种新的冠状病毒, 命名为MERS冠状病毒(MERS-CoV)。前2个属感染人及其他哺乳动物等, 后2个属主要感染禽类等脊椎动物。MERS-CoV被分在β 冠状病毒属, 该病毒属又可进一步分为a-d 4个群, MERS-CoV属于C群; 而引起严重急性呼吸综合征的冠状病毒(SARS-CoV)则属于B群已有报道冠状病毒已发现有60多种(图1)^[4]。冠状病毒形态结构在电镜下大同小异, 多表现为日冕状或皇冠状, 多为圆形或椭圆形, 表面呈突起状, 大的突起主要是刺突蛋白, 小的有膜成分在内。

图1

Fig.1

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	图1 冠状病毒科α 、β 、γ 和δ 4个属及其代表种[4]Fig.1 Four genera and representative species of coronaviridae

1.2.1 MERS-CoV的基因组及其功能 MERS-CoV是单股正链RNA病毒。全基因组一般超过30 000个核苷酸, 不同株间略有差别, 基因组分析分为A、B两亚群, 但A亚群只有少数株数, 主要都在B亚群。基因组有4个结构蛋白基因, 分别为刺突蛋白基因(Spike, S)、核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid, N)、膜蛋白基因(membrane, M)及包膜蛋白基因(envelope, E), 并有7个开放读码框(ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b), 前两个读码框占据整个基因组的2/3, 主要与病毒的复制有关; 后5个读码框编码辅助蛋白, 可能与毒株致病力有关; 还有位于基因组两端的5'、3'非编码区(untranslated region, UTR), MERS-CoV只和同一C群的冠状病毒基因组有同源性^{[5, 6, 7]}。

1.2.2 MERS-CoV蛋白的功能 MERS-CoV的4个结构蛋白S、M、E、N中, 以S蛋白最为重要。S蛋白以三聚体形式存在, 以机体的二肽酶(dipeptidyl peptidase-4, DPP4; 又称为CD26)为受体进入细胞, 开始进行病毒的生命循环。DPP4主要存在于多种哺乳动物的肾、小肠、肝和前列腺等脏器的上皮细胞表面, 在单峰骆驼中, DPP4存在于上呼吸道上皮细胞表面, 而在人类中, DPP4则多在肺泡表面表达。S蛋白在进入DPP4前, 裂解成S1和S2两个亚基, S1与DPP4的受体结合域(receptor-binding domain, RBD)结合, 此后S2使细胞与MERS-CoV膜融合, 促使病毒核酸进入细胞^{[7, 8]}。

S蛋白既存在可使病毒遗传物质进入机体的RBD, 又是进入宿主细胞的主要免疫原, 因此是研制药物的靶点和候选疫苗的主要目标蛋白。MERS-CoV能感染多种动物, 与DPP4能改变与S蛋白结合介面的静电荷有关^[8]。

其他3种蛋白M、E、N及辅助蛋白, M主要在病毒的外层, 起维护病毒形态的作用, 与S蛋白相互作用, 在E蛋白的辅助下, 病毒RNA能进入细胞浆进行复制; E蛋白具有较多的嗜水域, 为主在双脂膜的内层, 并和N衣壳蛋白相连, 在病毒出芽生殖中起作用, N衣壳蛋白最主要的作用在于裹胁、保护病毒的RNA; 辅助蛋白的作用可能与病毒的致病性有关, 现已明确, 包括M蛋白在内, ORF4a, ORF4b and ORF5编码的蛋白是1型干扰素的拮抗剂^{[7, 8]}。

自2012年6月发现1例死亡的MERS病例以来, 截至2020年4月底, 全球一共报告了2 519例实验室确诊的MERS病例, 其中866例死亡, 病死率为34.3%; 在确诊的病例中, 沙特阿拉伯报告2 121例, 约占84.2%, 病死788例, 病死率为37.1%。在中东以外国家发生的疫情较为少见, 病患通常有前往中东地区旅行史。2013年至 2018 年同期比较, 报告病例的人口学和流行病学特征无明显变化。 50~59 岁年龄组仍然是原发病例感染的最高风险人群, 死亡人数最多。30~39 岁年龄组人群最容易发生继发病例, 继发性病例死亡人数较多的为 70~79 年龄组。自 2015年以来, 由于医院感染预防和控制措施的改善, 医院获得性 MERS 病例数量显著下降^{[9, 10, 11]}。

2.2.1 蝙蝠是MERS-CoV的起源 1965年分离到首株人冠状病毒^[12], 2003年又从SARS患者体内分离出SARS-CoV。石正丽团队2013年从云南昆明的一洞穴菊头幅中分离的SARS-CoV样RaTG3毒株与SARS-CoV全基因组符合率高达96.2%, 研究表明该株既能利用果子狸受体ACE2, 也能利用人类受体ACE2, 说明SARS-CoV起源于蝙蝠^{[4, 15]}。而MERS-CoV与SARS-CoV同属于冠状病毒科β 属, 因此MERS-CoV也可能同样起源于蝙蝠; 其次MERS-CoV 属于β 属C群, 这一群包含了多种蝙蝠分离的种株, 如BtCoV-HKU4 和BtCoV-HKU5, 这也说明MERS-CoV与蝙蝠有关, 其起源可能也源于蝙蝠; 其三, 在2009-2011年对非洲加纳10种蝙蝠4 758只蝙蝠的粪便标本进行了RT-PCR检测, 在186只裂颜幅属种(Nycteris gambiensis)约有46只裂颜幅属种携带有2c β 冠状病毒; 欧洲有4种蝙蝠共272份粪便标本参与了检测, 在40份油幅(Pipistrellus)标本中检出2 c β 冠状病毒阳性, 核苷酸序列分析表明2 c β 冠状病毒符合率与MERS-CoV非常高。但蝙蝠栖息地附近均无人员或家畜被感染。2011 年9月在南非的Neoromicia cf. zuluensis蝙蝠中分离出非常类似于MERS-CoV的冠状病毒, 2012年10月, 在沙特离指标病例(index case)很近的1只墓幅属种( Taphozous perforatus)的粪便颗粒标本中用分段RT-PCR扩出与MERS-CoV 100%一致的核苷酸序列, 并在感染骆驼处的蝙蝠粪便标本中也扩增出192 bp的MERS-CoV片段, 虽然片段短了些, 但不是没有意义的。因此认为蝙蝠是MERS-CoV的储存宿主^{[13, 14, 15, 16, 17]}。

2.2.2 单峰骆驼作为传染性中间宿主的依据 Reusken等在发现MERS后, 对单峰骆驼、牛、绵羊、山羊和其他驼类家畜进行了MERS-CoV特异性抗体的研究, 只发现单峰骆驼有此类抗体。这意味着单峰骆驼可能是MERS-CoV的中间宿主, 但要证明它的传染性, 一是要从单峰骆驼呼吸道中能检出MERS-CoV; 二是血清流行病学也应该在单峰骆驼而不是其他动物中找到可抗MERS-CoV感染的中和抗体^{[18, 19]}。

2013年10月, 在卡塔尔一个农场, 发现了2个MERS病例, 卡塔尔CDC应急小组分别采集了该农场的14只单峰骆驼的鼻、肛拭子和血液, 用MERS-CoV 的上呼吸道E蛋白基因(upE)、ORF1a、N和S引物进行RT-PCR扩增, 分离病毒并作抗体中和试验分析, 用总共4.2 kb的6段扩增产物分别与MERS-CoV进行系统发生学关系的分析, 这些研究证明了单峰骆驼的冠状病毒与这2病例有关。同时, 调查1例沙特阿拉伯病例与其所饲养的9只单峰骆驼的关系, 因为其中4只单峰骆驼在显示流鼻滴的临床发病特征后, 这一47岁的男性才发病, 从该病患和其他4只单峰骆驼分离到的病毒存在很高的遗传符合率。2012年12月1日至2013年12月1日, 沙特按人口比例在全国范围抽检了1万多人查MERS-CoV, 得出阳性率为0.15%, 但中和抗体效价很高; 为检测环境暴露的影响, 2014年3-11月又抽检了30个实验室的人员及以116人为对照, 在沙特的13个区里有8个区实验室人员抗体阳性, 提示实验室存在MERS-CoV的环境污染。由卡塔尔和欧洲一道完成的另一个研究, 也提示少数与单峰骆驼接触者曾被MERS-CoV感染过。前者抽检了294例与单峰骆驼有职业接触的人员, 显示7%的接触者血液呈MERS-CoV中和抗体阳性, 而与欧洲合作抽检的204人的血液显示阴性结果。2013年沙特抽检了303只单峰骆驼, 其抗体阳性率达72%; 阿曼抽检了50只单峰骆驼, 阳性率为100%; 阿联酋抽检了500只, 其阳性率为96%。在非洲, 尼日利亚2010-2011年抽检了4个省358只单峰骆驼测抗体, 其阳性率为94%; 突尼斯2009-2013年抽检了分布于3个省的204只单峰骆驼, 其阳性率为48.5%; 埃塞俄比亚2011-2013年抽检了分布于3个省的188只单峰骆驼, 其阳性率为96.3%。上述这些检测, 都证实了单峰骆驼作为MERS-CoV 的中间宿主和传染源^{[20, 21, 22, 23, 24, 25]}。

2.2.3 传播途径及易感人群 人感染 MERS-CoV, 一般经呼吸道吸入被感染的单峰骆驼飞沫, 频繁密切接触被感染的单峰骆驼或病人^{[20, 26, 27]}。

Adney团队(2014)用牛冠状病毒为抗原, 从私人处购买了3只成年骆驼(分别编号为1、2、3, “ 1” 2岁, “ 2” 3岁; “ 3” 5岁, 并曾被阉割过), 他们将所试骆驼在接种前2周饲养在动物P3实验室里。用MERS-CoV(HCoV-EMC/2012型菌株)为攻击毒株, 接种之前用50% 空斑试验(TCID₅₀)定量, 病毒攻击总量为10⁷/15 mL; 尽量模仿自然感染的模式, 设置了3种传播途径和量, 这3种途径分别为气管(8 mL)、鼻腔(3.3 mL/单侧)和眼粘膜(0.2 mL/单只)。接种后1~2 d直至7 d, 可检出感染性的病毒(除“ 1” 于接种后第5 d麻醉处死外), 3号试驼至28 d仍可检出病毒RNA; 接种攻击14 d开始产生中和抗体, 3号在35 d后中和抗体效价可达1∶ 640; 从3只血液、粪便、尿液中均未分离到病毒或检出病毒RNA, 3只骆驼分别于5、28及42 d麻醉处死。临床症状观察从感染第1 d起即开始, 一般呈一过性非典型症状, 较为明显的是接种后1~5 d流鼻滴, 第2~5 d肛温有些升高。病理有些变化, 尤其是重症(“ 1” 号)单峰骆驼, 在咽后、纵隔、肠系膜和气管支气管淋巴结也检测到感染性病毒; “ 2” 在上呼吸道基本未见损伤, 在下呼吸道(气管、支气管和细支气管)的假分层上皮细胞中发现组织学损伤, 但在肺泡中没有发现组织损伤。3号在病理上基本未见变化, 也检不出MERS-CoV抗原。这个研究证实单峰骆驼存在MERS-CoV重、轻和无症状的感染, 人感染与单峰骆驼鼻腔喷出的飞沫和频繁密切接触有关^[27]。这种传播途径与韩国2015年的MERS疫情暴发类似^[28]。

DPP4 已被证实为MERS-CoV 的细胞受体, 该受体表达于人非纤毛支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞及巨噬细胞, 少数表达于上呼吸道上皮细胞, 因此, 支气管肺泡灌洗, 痰和气管等下呼吸道标本含有较高的病毒载量。WHO的指南要求同时收集患者上呼吸道和下呼吸道的标本检测, 期间应间隔2~3 d采集呼吸道样本, 直到临床痊愈。

应用血清进行抗体检测时, 确认感染需要双份血清标本。血清样本应间隔 3~4 周采集, 第1次采集应在症状开始的第1周进行。如果只能收集单一血清标本, 则至少应在症状出现后 14 d 进行。标本采集后应尽快送到实验室, 但可以在 4 ℃下存储和运输; 当有可能超过 72 h送达实验室时, 应将标本在-20 ℃下储存且用干冰运输, 应避免反复冻融标本。

常规确认 MERS-CoV 感染一般采用核酸扩增方法检测, 必要时通过核酸测序进行确认。不推荐将病毒分离培养作为常规的诊断方法。目前已开发出3种用于MERS-CoV 的 RT-PCR 检测试剂, 其中包括针对upE、ORF1b 和ORF1a基因的检测。针对upE检测因具有较高的灵敏度被推荐用于筛查, 针对ORF1a的检测与针对upE的检测具有相同的灵敏度, 而针对ORF1b的检测灵敏度则低于针对ORF1a 的检测。此外, 针对 MERS-CoV N蛋白基因的两种检测方法可作为upE和ORF1a的替代性检测。这些方法不与其他人冠状病毒有交叉反应。其流程见图2。

图2

Fig.2

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	图2 标本的核酸检测流程Fig.2 Nucleic acid detection process of specimen

血清学检测适用于按《国际卫生条例》需检测, 但因条件限制无法开展核酸扩增检测的人员; 应用血清学检测也用于确认 MERS-CoV 感染的病例、持续性暴发流行中的部分被调查人员感染的确认。一般血清学方法使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent, ELISA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay, IFA), 抗体呈4 倍以上增高可以作为确诊依据。

出于生物安全考虑, RT-PCR 检测时, 应在P2实验室生物安全柜中加样, 而进行病毒分离和中和试验时, 则必须在P3实验室进行^[32]。