目的 本实验通过研究对比不同时间两种肝棘球蚴病灶周围组织纤维化情况,进一步了解肝棘球蚴病的病理生理发展过程,为肝棘球蚴病的诊治提供参考。方法 建立动物模型,使用HE,Masson染色以及COL1,COL3、α-SMA、TGF-β1免疫组化染色对比观察两种肝棘球蚴病在不同时间纤维化情况的不同。结果 随着时间的变化肝细粒棘球蚴病灶周围纤维化由弥漫到聚集,可形成连续致密的纤维外膜;肝多房棘球蚴病灶周围组织纤维化始终为弥漫性,无法形成连续质密的纤维外膜。细粒棘球蚴组病灶周围COL1( r=-0.768, P<0.05)、COL3( r=-0.781, P<0.05)、α-SMA( r=-0.867, P<0.05)、TGF-β1( r=-0.854, P<0.05)的表达强度与时间呈负相关,多房棘球蚴组病灶周围COL1( r=-0.349, P>0.05)、COL3( r=-0.037, P>0.05)、α-SMA( r=-0.107, P>0.05)、TGF-β1( r=-0.148, P>0.05)的表达强度与时间无相关性。 无相关性同时观察到两种包虫周围细胞外基质胶原含量不同,细粒棘球蚴组I、III型胶原比高于多房棘球蚴组( Z=-3.23, P<0.05)。结论 相较于多房棘球蚴,细粒棘球蚴病灶周围可产生连续致密的纤维外囊。细粒棘球蚴在外囊形成后纤维化进程减弱或停止,多房棘球蚴在整个病程中均有活跃的纤维化反应。细粒棘球蚴相较于多房棘球蚴外囊的I/III型胶原比值较高。
In this study, the fibrosis of tissues around the lesions of two types of hepatic echinococcosis in different time periods was compared to increase understanding of the pathophysiological development of hepatic echinococcosis, and to provide information to aid the diagnosis and treatment of hepatic echinococcosis. The animal model was established, and HE, Masson and immunohistochemical staining of COL1, COL3, α-SMA and TGF-β1 were used to compare and observe the differences in fibrosis in the two kinds of hepatic echinococcosis at different times. The results showed that the fibrosis around the hepatic Echinococcus granulosus lesions changed from diffuse to aggregated with time, and could form a continuous and dense outer fibrous membrane. The fibrosis around the hepatic Echinococcus multilocularis lesions was always diffuse, and no continuous and dense outer fibrous membrane could be observed. The intensity of expression of COL1( r=-0.768, P<0.05)、COL3( r=-0.781, P<0.05)、α-SMA( r=-0.867, P<0.05)、TGF-β1( r=-0.854, P<0.05) around the lesions in the E. granulosus group was negatively correlated with time, while the intensity of expression of( r=-0.349, P>0.05)、COL3( r=-0.037, P>0.05)、α-SMA( r=-0.107, P>0.05)、TGF-β1( r=-0.148, P>0.05) around the lesions in the multilocular echinococcosis group was not correlated with time . The collagen content of the extracellular matrix around the two types of hydatid was different. The collagen type I and III ratio of the E. granulosus group was higher than that of the E. multilocularis group( Z=-3.23, P<0.05). Compared with multilocular echinococcosis, continuous and dense fibrous outer sacs can be formed around the lesions of E. granulosus. After the formation of the outer cyst, the process of fibrosis was weakened or stopped. The cases of multilocular echinococcosis showed active fibrosis throughout the course of the disease. E. granulosus has a higher type I/III collagen ratio than the outer capsule of E. multilocularis.
棘球蚴病是一种世界范围的人兽共患病, 以细粒棘球蚴绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球蚴绦虫(Echinococcus multilocularis, Em)幼虫引起的疾病最为常见[1]。棘球蚴病可发生在肝、肺、脑等部位发生, 肝脏是其最常见的好发部位[2, 3, 4]。棘球蚴寄生于肝脏后会引起周围组织炎症反应、肉芽组织增生、纤维化、钙化等一系列病理生理变化, 其中纤维化会伴随整个寄生过程[5]。由Eg引起的肝囊型包虫病(Cystic echinococcosis, CE)和由Em引起的肝泡型包虫病(Alveolar echinococcosis, AE)周围组织纤维化情况有所不同, 造成两种棘球蚴的治疗方式不同。前期研究发现包虫周围组织纤维化主要由I型胶原(CollagenⅠ , COL1)、Ⅲ 型胶原(CollagenⅢ , COL3)、Ⅳ 型胶原(CollagenⅣ , COL4)构成, 其中COL1、COL3的含量较高[6, 7]。本实验通过HE、masson、免疫组化染色, 对比小鼠不同时间段两种包虫纤维化进程的区别, 进一步了解多房棘球蚴体内生长发育过程, 从而寻找更好的诊疗方案。
1.1.1 主要耗材 本实验所用一抗(COL1:ab34710; COL3:ab184993; α -SMA:ab124964; TGF-β 1:ab92486)、Masson染色试剂盒来自abcam公司, HE染色试剂盒来自生工生物工程(上海)股份有限公司, 免疫组化二步法试剂盒(PV-6001)来自北京中杉金桥生物技术有限公司, 1640培养基来自gibco, 青链霉素混合液来自北京索莱宝科技有限公司, 胎牛血清来自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.1.2 主要仪器 Leica轮转式切片机(RM2245), 蔡司显微镜(Axio Imager 2), 赛默飞Excelsior AS自动组织脱水机, 赛默飞公司二氧化碳培养箱(Heracell 240i), Eppendorf公司移液器。
1.1.3 实验动物 来自北京维通利华实验动物技术有限公司, 1月龄雌鼠90只。1.2 原头节的提取
1.2.1 细粒棘球蚴 屠宰场购买患病羊肝(本地牲畜屠宰场, 现场无菌封装), 从中提取细粒棘球蚴原头节, 用含有双抗的PBS清洗数遍后, 放入含10% FBS的RPMI-1640培养基中待用。用伊红染色剂鉴定原头节活性, 活性大于90%可用。
1.2.2 多房棘球蚴 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心购SPF级长爪沙鼠(Meriones unguiculatus), 腹腔种植多房棘球蚴原头节, 6月后开腹提取腹腔多房棘球蚴组织, 经过研磨、过滤、清洗提取出多房棘球蚴原头节。用伊红染色剂鉴定原头节活性, 活性大于90%可用。
选用健康雌性1月龄的C57BL/6小鼠90只, 分为细粒棘球蚴组30只、多房棘球蚴组30只和对照组30只, 细粒棘球蚴组、多房棘球蚴组分别进行肝被膜下注射5 000个相应原头节, 对照组肝被膜下注射等量的RPMI-1640培养基[8]。造模完成后分别于30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d 收取小鼠肝脏标本。
小鼠肝脏取得后使用PBS缓冲液冲洗3次, 放入4%中性甲醛中浸泡48 h, 全自动脱水机脱水处理, 石蜡包埋, 制成3 μ m石蜡切片。
HE染色:脱蜡至水, 中性苏木素染色6 min, 清水冲洗10 min, 盐酸酒精分化, 伊红染色1 min。免疫组织化学染色:抗原修复采用pH6枸橼酸高压修复法, 染色采用EnViSion二步染色。
本实验使用SPSS 20.0进行统计学分析, 计数资料使用卡方检验进行比较, 理论频数小于1的分组使用Fisher’ s确切概率法, 计量资料符合正态分布的使用t检验进行比较, 如果不符合正态分布使用秩和检验进行比较。P< 0.05为差异有统计学意义。
动物模型两种包虫不同时期的HE染色可观察到, 细粒棘球蚴组30 d未形成囊肿, 存在变形增大的原头节, 以及大量炎症细胞浸润, 30~60 d形成囊肿组织, 可见完整的内囊壁, 内囊周围有较厚的炎症带, 60~120 d内囊逐渐增厚, 内囊周围炎症带逐渐减少至消失, 外囊逐渐形成, 120~180 d内囊壁、外囊壁逐渐增厚, 囊肿对周围组织挤压明显。
多房棘球蚴组30 d头节注射部位可见大量炎细胞浸润, 肉芽组织增生, 未见囊肿形成, 未见完整的原头节。囊肿形成在30~60 d, 90 d后可观察到囊肿向周围组织浸润现象, 囊肿无固定形态, 120 d后囊肿继续增长, 出现玻璃样变纤维组织, 180 d组可见大面积玻璃样变纤维组织, 其中包含大量大小不同的囊肿。AE生长过程中内囊壁增厚不明显且对周围组织的浸润、侵袭始终存在。
Masson染色细粒棘球蚴组30 d可观察到病灶周围炎症浸润及肉芽组织增生区域内分泌大量胶原纤维蛋白, 60 d可见胶原纤维蛋白在内囊外侧聚集, 90 d可见炎症及肉芽组织区域面积减少, 在内囊外侧沉积的纤维蛋白形成纤维外囊, 120~150 d可见炎症及肉芽肿区域减退至消失, 胶原蛋白纤维由弥漫分布逐渐形成连续致密的纤维外囊, 180 d纤维外囊进一步致密增厚。
多房棘球蚴组30 d见病灶周围炎症浸润及肉芽组织增生区域内分泌大量胶原纤维蛋白类似于细粒棘球蚴组, 60~90 d可见纤维蛋白在内囊外侧弥漫性分布无明显聚集现象, 90~150 d胶原纤维蛋白仍呈弥漫性分布, 有聚集形成外囊的现象但是相较细粒棘球蚴组, 其外囊较为疏松, 未见形成连续致密的纤维外囊, 在多房棘球蚴病灶中形成的玻璃样变纤维化组织中可见大面积胶原蛋白分布, 如图2L。
在细粒棘球蚴组COL1、COL3免疫组化染色, 观察到两种胶原蛋白的分布符合Masson染色胶原纤维的分布情况, COL1、COL3在包虫周围炎症浸润及肉芽组织增生区域分布高于其他区域, 且两种胶原蛋白的分布在该区域中由弥散性逐渐聚集成完整连续的纤维外囊, 见图3和图4。
多房棘球蚴组COL1、COL3在包虫周围炎症浸润及肉芽组织增生区域分布高于其他区域, 其中相较于同一时期细粒棘球蚴组COL1在病灶周围的表达相对较低。病灶周围COL3高表达, 但弥散性分布无法聚集成完整纤维外囊。
对小鼠肝组织COL1、COL3的表达强度进行分析, 对照组小鼠肝细胞COL1、COL3呈弱阳性(+)表达, 因此统计阳性(++)和强阳性(+++)的表达率如表1, 使用Fisher’ s精确检验COL1的表达, CE组对比NC组(P=0.000< 0.05), AE组对比NC组(P=0.000< 0.05), COL3的表达CE组对比NC组(P=0.000< 0.05), AE组对比NC组(P=0.000< 0.05), 差异均有统计学意义。为观察COL1、COL3表达强度与天数之间的关系, 绘制散点图及拟合线, 并进行相关性分析(表2、图5), CE组COL1的表达强度与时间呈负相关(P=0.000< 0.05), CE组COL3的表达强度与时间呈负相关(P=0.000< 0.05), AE组COL1的表达强度与时间无明显相关性(P=0.059> 0.05), AE组COL3的表达强度与时间无明显相关性(P=0.848> 0.05), 随着细粒棘球蚴完整纤维外囊的形成, 细粒棘球蚴病灶周围的COL1、COL3表达降低, 多房棘球蚴病灶周围COL1、COL3表达随时间变化不明显。对比COL1、COL3的表达时发现CE中两种胶原蛋白的比值相较于AE组有差异, 使用ImageJ软件计算两种胶原蛋白的表达面积, 并计算出不同时间段COL1/COL3表达面积比值进行比较, CE组高于AE组, 如图6使用秩和检验将CE组全部标本与AE组全部标本的COL1/COL3进行对比(Z=-3.23, P=1.2× 10-3< 0.05), 差异有统计学意义。
α -平滑肌肌动蛋白(α -SMA)免疫组化染色可见, 对照组中仅在血管壁中表达, 实验组主要表达在炎症浸润及肉芽组织增生区域。随着细粒棘球蚴组连续致密的纤维外囊形成, α -SMA表达逐渐减少, 直至180 d 组可见其囊周表达基本消失。多房棘球蚴组炎症浸润及肉芽组织增生区域始终存在, α -SMA在整个试验周期中均有较高的囊周表达, 见图7。
TGF-β 1免疫组化可见, 对照组肝细胞中有TGF-β 1表达, 高表达于囊周组织, 在细粒棘球蚴组中可见随着致密纤维外囊的形成TGF-β 1的表达逐渐减少, 多房棘球蚴组囊周持续有TGF-β 1高表达, 见图8。
α -SMA、TGF-β 1在病灶周围表达强度情况如表3, 使用Fisher’ s精确检验α -SMA的表达CE组对比NC组(P=0.000< 0.05), AE组对比NC组(P=0.000< 0.05); TGF-β 1的表达CE组对比NC组(P=0.000< 0.05), AE组对比NC组(P=0.000< 0.05), 差异均有统计学意义。为观察α -SMA、TGF-β 1表达强度与天数之间的关系, 绘制散点图及拟合线, 并进行相关性分析如表4、图9, CE组α -SMA的表达强度与时间呈负相关(P=0.000< 0.05), CE组TGF-β 1的表达强度与时间呈负相关(P=0.000< 0.05), AE组α -SMA的表达强度与时间无明显相关性(P=0.573> 0.05), AE组TGF-β 1的表达强度与时间无明显相关性(P=0.437> 0.05)随着细粒棘球蚴完整纤维外囊的形成, 细粒棘球蚴周围的α -SMA、TGF-β 1表达降低, 多房棘球蚴病灶周围α -SMA、TGF-β 1表达随时间变化不明显。
CE、AE两种疾病均为慢性占位性病变, 但是在生长模式、治疗方案上有较大的差异。CE因为其与周围组织有明确的界线, 转移病灶较少, 手术治疗后可治愈[9, 10]。AE虽然从组织病理学上看是一种良性疾病, 但它表现出恶性疾病的特点, 生长过程中对周围组织具有破坏性、侵犯邻近器官和远处播散的特点[11], 因此被称为“ 虫癌” 。目前早期根治性手术可以提高患者生存质量、生存周期[12]。两种疾病引起周围组织纤维化模式不同是造成以上差异的重要因素。
TGF-β 通路是纤维化过程中重要的信号通路, 其中TGF-β 1被认为是TGF-β 通路的主要启动因子之一[13]。TGF-β 1在组织修复、炎症反应、星状细胞的活化及细胞外基质分泌等过程中起主要调节作用[14]。在肝脏中TGF-β 1是提高肝纤维化最有效的因子之一, 可以激活肝星状细胞, 同时可以提高肉芽组织中成纤维细胞α -SMA mRNA的表达[15]。肝星状细胞在纤维化过程中有重要作用, 在炎症及损伤等因素的过程中, 肝星状细胞分泌多余的细胞外基质(ECM)在肝脏中导致纤维化[16]。肝星状细胞在包虫的持续刺激下激活转化为肌成纤维细胞表达α -SMA[17], 因此在肝脏中α -SMA通常作为肝星状细胞活化的标志物, 反映了星状细胞活化和由疾病引起的持续坏死性炎症的进展情况[18]。对细粒棘球蚴侵入肝脏, 会引起病灶周围炎症反应并形成肉芽肿[19], 肝星状细胞被激活, 分泌大量细胞外基质及细胞因子导致ECM过度沉积即周围肝组织纤维化形成完整致密的纤维外膜。纤维外膜的形成能在一定程度上限制棘球蚴的生长发育, 与周围肝组织形成明确的界线; 在完整的纤维外囊形成过程中, 囊周的炎症及肉芽组织增生反应减弱直至消失, α -SMA、TGF-β 1在囊周的表达也逐渐减弱, 纤维化进程也逐渐减缓; 可以说完整的纤维外囊可以减轻寄生虫与宿主间的抗原抗体反应以及纤维化反应。对于多房棘球蚴组, 周围肝组织弥漫性纤维化, 无法形成完整致密的纤维外膜, 囊周α -SMA、TGF-β 持续高表达, 可以认为囊周持续有活跃的纤维化反应, 弥漫性纤维化无法限制棘球蚴的生长发育, 可以造成大面积肝组织纤维化、玻璃样变纤维化, 影响肝功能。
实验中发现多房棘球蚴相较于细粒棘球蚴病灶周围I型胶原的表达较低。由于I型胶原和III型胶原结构不同而具有不同的性质。I型胶原由机械强度较高而顺应性较差的原纤维组成, 而III型胶原纤维弹性好, 顺应性较好, 机械强度较低[20]。研究表明I/III型胶原比例对各种组织的功能完整性至关重要, 增加I型胶原的降解或增加III型胶原的沉积可能有助于对抗组织间质基质的高强度低顺应性[21]。在扩张性心肌病中I/III型胶原比例增高心脏的强度增大, 组织顺应性下降[22, 23], III型分泌增多导致I/III型胶原比例降低, 使得结缔组织机械强度降低[24]。由图3、4、6可见多房棘球蚴组囊周I/III型胶原比例小于细粒棘球蚴组, 这也可能是细粒棘球蚴囊周产生连续致密纤维外囊而多房棘球蚴较少产生完整纤维外囊的原因之一。如果使多房棘球蚴囊周形成连续致密囊壁, 将在一定程度上限制多房棘球蚴的生长、转移, 减轻宿主炎症反应, 同时有助于多房棘球蚴的手术治疗。如何使多房棘球蚴囊周形成连续致密的纤维外膜, 有待进一步研究。
利益冲突: 无
引用本文格式:邢稚坤, 王二强, 廖原, 等.小鼠肝细粒棘球蚴和多房棘球蚴病不同时期病灶周围组织纤维化对比[J].中国人兽共患病学报, 2021, 37(11):1008-1016. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.140
编辑:张智芳
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