不同的解聚酶在作用底物、理化性质等方面具有显著差异, 但它们具有相似的保守结构特征。大部分解聚酶存在于噬菌体尾丝的底板部位, 一般构成同源三聚体(其中也有例外, 如大肠杆菌噬菌体 63D 的解聚酶呈现同源四聚体结构^[9])。每一个亚基都是平行的右手β -螺旋结构, 该结构有利于拓展活性位点, 可识别多糖结构并与其更紧密地贴合。正是由于这种三聚体以及每个亚基的β -折叠高度交织的结构, 使解聚酶的化学性质十分稳定, 可以在较宽泛的温度区间和pH值区间内都能保持活性^{[9, 13, 14]}。

解聚酶因底物的不同而具有不同结构, 但解聚酶所在的尾尖蛋白结构具有一定相似性。一般地, 尾尖蛋白结构可以分为3个部分:N-末端结构域、中间结构域及C-末端结构域。以鲍曼不动杆菌噬菌体Φ AB6为例, 其尾尖蛋白TSP三聚体结构中的一个单体如图1所示^[15]。N-末端结构域可对应图中particle-binding domain, 一般用于受体结合蛋白(receptor binding protein, RBP)或受体结合区(receptor binding domain, RBD)与尾丝结构或底板结构的连接; 中间结构域的空间占比较大, 活性部分可对应图中RBD, 一般用于宿主的识别和发挥解聚酶活性; C-末端结构域即C-terminal domain, 一般用于解聚酶单体蛋白的三聚体化, 同时也发挥受体识别的作用。对于同一噬菌体群, 其N-末端和C-末端的结构域是保守的, 但中间结构域的可变性很大, 用于适应不同宿主以及不同生存环境^[13]。

图1

Fig.1

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	图1 Φ AB6 尾尖蛋白(TSP)单体的结构域[15]Fig.1 Domains in a TSP monomer[15]

除上述的尾丝自身结构外, 还存在很多噬菌体通过附加在尾部的辅助结构域来介导与宿主的识别。例如部分长尾噬菌体和肌尾噬菌体, 在其尾部蛋白的C-末端结合有Ig样结构域, 目前推测该结构域与细胞表面糖类结构的结合作用有关^[13]。

根据解聚酶的存在形式可分为以下两类:其一是作为噬菌体结构的组成部分, 其二是裂解宿主细胞过程中产生的可溶性蛋白质。绝大多数的噬菌体解聚酶属于第一种类型, 而第二类解聚酶不与结构基因有关, 目前尚无法进行认定分类。本篇综述将着重讨论作为噬菌体的结构— — 尾丝蛋白复合物的组成部分而存在的解聚酶。

根据解聚酶的作用机制不同, 可分为水解酶和裂解酶两大类。这两种解聚酶的作用方式将细菌的肽聚糖、荚膜多糖或脂多糖降解为低聚糖。

2.2.1 水解酶 此类解聚酶的作用机制为催化糖苷键水解, 包括唾液酸酶、乙酰化酶、木糖苷酶、葡聚糖酶、鼠李糖胺酶等。以唾液酸酶为例, 唾液酸酶作用于多聚糖末端的唾液酸的α -键。唾液酸广泛存在于细胞表面寡聚糖的末端, 并且在多种致病菌中, 唾液酸屏障都具有免疫防御的作用, 与细菌致病力相关。唾液酸酶的作用可能对细菌生存没有直接影响, 但荚膜结构的破坏使细菌对补体等的杀菌作用更加敏感, 并且增强了巨噬细胞的吞噬作用^[8]。

近年来研究发现, 不同解聚酶对其作用的底物有不同的作用结构, 并有其特异性的作用方式。如大肠杆菌噬菌体 HK620的尾丝蛋白 TSP 具有内切N-乙酰氨基葡糖苷酶活性, 可以分解宿主菌表面脂多糖的O抗原, 能将O抗原的六糖重复序列分解为六糖分子。缺失N-末端结构域的TSP(TSPΔ D)为三聚体结构, 三聚体轴心可平行地结合细菌O抗原六糖重复序列结构的一个六糖结构(如图2)。TSPΔ D的每一个单体结合位点都位于β -螺旋结构域, 结合槽表面带有负电荷, 能与一个六糖结构形成17个氢键, 随后通过水解产生的六糖分子, 其还原端均具有N-乙酰氨基葡萄糖。由于空间限制, TSPΔ D的结合槽内每次只能容纳一个六糖序列, 理论上若仅从O抗原的外端进行切割, 产物应为单一的六糖分子, 然而通过分析裂解产物发现还存在更长的糖链, 因此推测也存在从O抗原的内端进行切割的情况^[16]。

图2

Fig.2

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	图2 缺失N-末端结构域的尾丝蛋白(TSPΔ D)与六糖重复序列结合的晶体结构(A)和六糖重复序列的结构(B)[16]E372为Glu372, D339为Asp339。Fig.2 Crystal structure of hexasaccharide repeat bound to HK620 TSPΔ D (A) and hexasaccharide repeat structure (B)[16]

除了对大肠杆菌的噬菌体及解聚酶研究较深入外, 也有研究对肺炎克雷伯菌的噬菌体及其解聚酶作用机制开展了较全面的研究。如研究发现肺炎克雷伯菌噬菌体KP32的尾丝蛋白 KP32gp38 具有解聚酶活性。其酶的催化结构为一个“ 催化口袋” , 在这个“ 口袋” 中存在4个重要的氨基酸残基, 分别是:Glu¹⁷⁰, Asp²²⁹, Glu²³⁹和Asp²⁴¹(如图3C)。该糖苷水解酶通过以上氨基酸残基的羧基之间的距离(Glu²³⁹与Asp²²⁹的羧基间距; Asp²⁴¹与Glu¹⁷⁰的羧基间距)来实现其生理活性— — 羧基间的距离不同, 糖苷酶的作用机制也将发生变化。而在尾丝蛋白 KP32gp38 催化位点的邻近部位还有一个结构, 称为糖类结合模块(carbohydrate binding modules, CBMs)(如图3A、B)。该模块的顶端区域含有芳香残基, 这一类残基可通过其芳香环与糖类底物间成键, 从而将底物锚定于催化位点的邻近部位, 并促进催化作用。根据噬菌体家族的不同, CBM的糖类结合位点以及结合糖类的特异性可能不同^[17]。

图3

Fig.3

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	图3 KP32gp38三聚体外观示意图(A)、KP32gp38三聚体各结构域横截面(B)和“ 催化口袋” 中重要的氨基酸残基的羧基间距示意图(C)[17]E170为Glu170, D229为Asp229, E239为Glu239, D241为Asp241。Fig.3 Structure of KP32gp38 trimer (A), top view of isolated domains (B), and distances among important residues in the catalytic pocket (C)[17]

2.2.2 裂解酶 裂解酶是通过β 消除机制裂解β -1, 4糖苷键, 过程中不利用水分子, 如透明质酸裂解酶、藻酸盐裂解酶和果胶裂解酶等。以透明质酸裂解酶为例, 透明质酸是一种线性未硫酸化的糖胺葡聚糖聚合物, 葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、链球菌等具有透明质酸裂解酶, 可以增加组织渗透性, 增强其致病力。在一些前噬菌体中也可发现该酶, 用于突破细菌荚膜以及促进溶原性转化。细菌细胞壁的肽聚糖结构是由N-乙酰葡糖胺(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)两种单糖互相间隔连接成长链, 这种肽聚糖分子交织覆盖在细胞膜上。从结构来看, 部分解聚酶能作用于肽聚糖分子间的联合键, 如:N-乙酰基-β -D-氨基葡萄糖苷酶可切割NAG、NAM间的β -1, 4糖苷键; N-乙酰基-β -D-胞壁质酶可切割NAM和NAG间的β -1, 4糖苷键; N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶可切割切割糖基与肽间的的酰胺键等^[18]。

针对大肠杆菌K5菌株的噬菌体K5A能编码一种裂解酶KflA, 该裂解酶存在于尾丝蛋白, 可裂解K5的荚膜多糖上的重复序列。Kf5A由三聚体构成, 每个单体可分为3部分— — N-末端的α -螺旋结构域、中段单链、C-末端的右手β -螺旋结构域。3个单体在C-末端缠结。Kf5A中主要起催化β -消除反应的氨基酸残基是Glu²⁰⁶和Lys²⁰⁸。Glu²⁰⁶的羧基从C5获得质子, 发生质子化; 葡萄糖醛酸的C5的质子发生解离; 质子化的Glu²⁰⁶的羧基和去质子化的葡萄糖醛酸的C5之间形成氢键。Lys²⁰⁸作为中间传递体, 接受C5的质子并将其传递给糖苷键上的氧原子, 通过上述过程实现裂解糖苷键作用^{[19, 20]}。

除此以外, 极少部分的噬菌体具有脂肪解聚酶, 其作用于三酰基甘油的羧基酯键的酶, 可释放有机酸和甘油。目前在某些嗜纤维素菌属噬菌体和假单胞菌噬菌体中发现脂肪解聚酶结构域的存在^[8]。

对于不同科的噬菌体, 解聚酶的所在位置也可不同。对于肌尾噬菌体科, 其尾丝上可能存在的解聚酶有唾液酸酶或果胶裂解酶:底盘上可能存在的解聚酶有唾液酸酶、果胶裂解酶或肽酶; 对于短尾噬菌体科, 其颈部可能有唾液酸酶或果胶裂解酶, 尾丝可能有唾液酸酶或果胶裂解酶, 底盘可能有果胶裂解酶; 对于长尾噬菌体科, 颈部可能有唾液酸酶或果胶裂解酶, 尾丝可能有果胶裂解酶, 底盘可能有唾液酸酶或果胶裂解酶^[8]。

尾丝蛋白的解聚酶活性范围较广泛, 对环境的要求较低。如鲍曼不动杆菌的新型肌尾噬菌体(vB_AbaM_B9), 其荚膜解聚酶B9gp69在一个很宽泛的pH值(5~9)、离子强度(0~500 mmol/L)和温度(20 ℃~80 ℃)范围内都能保持活性。并且在体外人肺细胞、哺乳动物细胞和人血清模型中进行试验, 证明B9gp69对细胞无害。人血清中, K45菌株对血清的补体杀伤具有抗性, 而经过解聚酶B9gp69处理后, K45菌株对体外血清敏感并被杀灭^[21]。

噬菌体解聚酶具有其各自发挥作用的最佳环境, 在特定条件下表现出最大活性。以针对大肠杆菌K1型荚膜多糖的大肠杆菌噬菌体的神经氨酸酶为例:其表现最大活性的酸碱度区间在pH 5.2到5.5。缓冲液的摩尔浓度同样对酶活性大小造成影响:在磷酸盐和乙酸盐缓冲液中, 神经氨酸酶的最大Kl水解速率均为0.05 mmol/L。向乙酸盐缓冲液中添加9 mmol/L CaCl₂会严重降低酶的活性, 在此基础上再加入155 mmol/L NaCl, 抑制作用将更为明显^[21]。

为了适应荚膜多糖结构以完成侵染, 解聚酶可发生结构变化。通常来说, 自然发生的适应可以有以下两种类型:

其一, 通过突变来改变活性位点, 属于垂直转移。此种突变一般发生在中间结构域, 并且不会改变β -螺旋结构。噬菌体可以通过改变蛋白的折叠方式, 使同一肽链因最终空间构象的不同而能够适应不同的底物^[9]。

其二, 通过与其他噬菌体进行多糖识别结构域的交换来实现特异性的改变。这类噬菌体通常具有高度保守的N-末端结构域, 因其与解聚酶与尾丝结构或底板结构的连接相关。有的噬菌体还进化出更复杂的受体结合蛋白RBP结构来实现解聚酶和病毒体的连接^[9]。