甘肃省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及地区分布
郭丽民1, 席进孝1, 葛亚俊2, 王宇萌3, 苗克军1, 吴斌1, 徐大琴1
1.甘肃省疾病预防控制中心,兰州 730020
2.复旦大学附属公共卫生临床中心,上海 201058
3.中国疾病预防控制中心,北京 102206
通讯作者:席进孝,Email: xijxxp@163.com; ORCID: 0000-0001-7418-6184
摘要

目的 采用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)对甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行基因分型,探讨甘肃省鼠疫菌地区分布特征。方法 选取1962-2014年间甘肃省各市县(区)不同生态型的鼠疫菌198株,培养并提取基因组DNA。采用14+12对引物进行PCR扩增,产物进行测序,确定每对引物串联重复序列(VNTR)位点的拷贝数。应用BioNumerics 5.10软件对菌株的VNTR位点拷贝数进行聚类分析。结果 甘肃省鼠疫菌分为10个群,群内的菌株依据分离地点继续细化为5-28个分支。10个群分别为:阿拉善黄鼠疫源地菌株聚为1个群;甘南高原疫源地菌株聚成1个群;阿克塞县菌株分成2个群,为当金山群和加尔乌宗村群;肃北县菌株分为3个群,为马场群、党城湾镇群和鱼儿红群;玉门市菌株聚集在肃北县鱼儿红群内;肃南县菌株分为3个群,为大河乡群、马蹄乡群和康乐乡群。结论 MLVA可以清晰地区分甘肃省不同鼠疫疫源地的菌株,将疫源地内菌株继续细分为不同分支,直至精确的分离地点。MLVA分型方法可用于鼠疫菌株的溯源分析。

关键词: 鼠疫耶尔森菌; MLVA; 地区分布
中图分类号:R378.6 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2021)08-0715-06
Genotyping by MLVA reveals the regional distribution of Yersinia pestis in Gansu Province
GUO Li-min1, XI Jin-xiao1, GE Ya-jun2, WANG Yu-meng3, MIAO Ke-jun1, WU Bin1, XU Da-qin1
1. Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Lanzhou 730020, China
2.Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201058, China
3.Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Xi Jin-xiao, Email:xijxxp@163.com
Abstract

Multiple variable number tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA) was used to study the genotypes and distribution of Yersinia pestis in Gansu province. Different ecotypes of Yersinia pestis from 1962 to 2014 were selected for genotyping by MLVA. PCR amplification was carried out at the 14 + 12 VNTR loci, and the amplicons were analyzed by capillary electrophoresis to determine the repeat number of each VNTR locus. The data were analyzed with BioNumerics 5.10. The strains of Y. pestis in Gansu province were divided into ten genotypes. The strains from different foci clustered into different types, which correlated well with the isolation sites. According to the isolation sites, the strains in the types were further subdivided into 5-28 subbranches. The ten genotypes included strains from the Spermophilus alaschanicus plague focus in one type; those from the Gannan Plateau plague focus in one type; those from Akesai County in two types; i.e., those from Dangjinshan and Jiaerwuzong village; those from Subei County in three types; i.e., the types from Machang, Dangchengwan Town and Yuerhong; those from Yumen City, which shared the same type as those from Yuerhong in Subei County; and those from Sunan County in three types; i.e., types from Dahe Town, Mati Town and Kangle Town. The MLVA (14 + 12) scheme can be used to distinguish strains from different plague foci in Gansu province, and the genotypes correlate well with the plague bacteria isolation sites. This method can be used for source tracing of Yersinia pestis.

Key words: Yersinia pestis; MLVA; regional distribution

鼠疫是一种流行在啮齿动物间通过蚤传播的自然疫源性疾病, 病原体为鼠疫耶尔森菌。鼠疫菌对糖、醇的酵解能力是生化分型的重要指标之一。纪树立等[1]根据鼠疫菌生物学特征, 将我国不同类型鼠疫疫源地分离的鼠疫菌株分为17个生态型。段永明等[2]将甘肃省鼠疫疫源地分离的菌株分为阿尔金型、青藏型、祁连型和甘宁黄鼠型。不同生态型的鼠疫菌均占有一块各自相对独立的疫源地分布区, 而且菌株在分布区内占有优势。各疫源地动物间鼠疫流行强度的差异, 使得菌株在适应环境的变化过程中遗传特征发生变化, 这种变异被保存下来, 造成不同疫源地间菌株在基因上的差异。由于甘肃省动物间鼠疫流行猛烈, 常波及人间鼠疫疫情流行, 而且非法猎捕贩运旱獭容易造成鼠疫远距离传播, 为此需要利用简单经济的分子分型方法对鼠疫疫情进行溯源分析。VNTR在鼠疫菌基因组中分布广泛, 可以通过分析多个位点的变异信息, 进行鼠疫菌基因分型和进化分析, 即MLVA(Multiple locus variable number tandem repeat analysis)方法。本实验室早期利用15个VNTR位点进行鼠疫菌株的基因分型, 只将鼠疫菌株分为两个群, 不能区分不同生化型的鼠疫菌株[3]。本次研究采用MLVA(14+12)分级分型的方法对甘肃省鼠疫菌株进行基因分型[4], 以期建立甘肃省鼠疫菌VNTR位点多态性数据库, 为鼠疫疫情的鉴定溯源提供理论支持。

1 材料与方法
1.1 菌株来源及DNA制备

选取甘肃省1962-2014年间198株鼠疫菌, 其中甘宁黄鼠型菌株6株、青藏型菌株128株、祁连型菌株46株、阿尔金型菌株18株。菌株保藏于甘肃省疾病预防控制中心鼠疫防制科。鼠疫菌DNA提取参照文献[5]进行, 置-20 ℃保存。

1.2 仪器及试剂

PCR基因扩增仪(美国Bio-Rad公司), 凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司), 3730(美国ABI公司), 5415D小型高速离心机(德国Eppendorf公司), 水平电泳仪(北京六一仪器厂)。PCR扩增试剂购自北京全式金生物技术有限公司, DL1000(宝生物有限公司), 琼脂糖(西班牙Biowest公司), 低分子量Markers和500liz、1200liz内标marker(北京赛百盛基因技术有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 引物 采用14+12对VNTR引物[4, 6], 引物信息见表1

表1 14+12对MLVA引物序列信息 Tab.1 Sequence information on 14+12 MLVA primers

1.3.2 PCR反应体系及条件 反应体系:Premix Ex Taq 12.5 μ L, 10 μ mol/L 上下游引物各1.0 μ L, 模板DNA 2 μ L, 补水至25 μ L。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性1 min, 最适退火温度1 min, 72 ℃延伸1 min, 30个循环, 72 ℃ 延伸5 min。引物为M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、M25、M23 时, 退火温度为60 ℃, 引物为MS09、N2486、MS73、MS41、M34、M33、M22、M43、M28、M29时, 退火温度为55 ℃, 引物为N3779、N2896、N0865、N2976、N1606、N2577、N3773、N2117体系的退火温度为52 ℃ 1 min。

1.3.3 水平琼脂糖凝胶电泳 取5 μ L PCR产物, 与1 μ L 6× loading buffer混合后, 采用1.5%琼脂糖凝胶电泳后, 凝胶成像分析有无产物和非特异性扩增、核对扩增产物大小。

1.3.4 PCR产物拷贝数的确定 将PCR产物送专业技术服务公司(北京睿博兴科生物技术有限公司)进行毛细管电泳, 根据分子量大小确定各个位点的拷贝数。

1.3.5 聚类分析 统计菌株各个位点的拷贝数, 采用BioNumerics5.10软件, 采用效用均等的分类资料分析方法对各对引物的拷贝数进行聚类分析。为加强MLVA分型方法中14个低变异度指标在鼠疫种群中的区分能力, 减弱高变异度的12个指标对聚类关系的影响, 将第一级分型14个指标的权重设为2, 用于种内溯源分析的12个指标权重设为1[7]。甘肃省1∶ 25万矢量化镇(乡)地图由中国疾病预防控制中心提供。采用ArcGIS10.3软件进行鼠疫菌MLVA类群地区分布特征分析。

2 结 果
2.1 甘肃省鼠疫菌VNTR拷贝数结果

“ 14+12” 个VNTR位点在甘肃省鼠疫菌基因组中拷贝数的结果见表2。与已完成全基因组测序的东方型鼠疫菌株CO92的VNTR位点拷贝数比较, 26个VNTR位点均表现出不同于CO92的拷贝数。引物M34拷贝数变化类型最多, 为17种, 而最少的拷贝数变化类型为2种, 说明26对引物的分辨能力高, 能将甘肃省鼠疫菌株分为不同的基因型。

表2 14+12个VNTR位点在甘肃省鼠疫菌株基因组中的拷贝数变化类型 Tab.2 Types of copies of 14 + 12 VNTR loci in Yersinia pestis from Gansu Province
2.2 甘肃省鼠疫菌MLVA基因型及地区分布

“ 14+12” 个VNTR位点将198株鼠疫菌分成1-127型, 基因分型比较复杂。阿拉善黄鼠疫源地(会宁县和平川区)MLVA基因型有122、124-127型; 甘南高原疫源地(夏河县)MLVA基因型有39-43型; 阿尔金山鼠疫源地(阿克塞县)MLVA基因型有89-115型; 大雪山鼠疫疫源地(肃北县和玉门市)有44-68型、69-88型、116-119型, 祁连山北麓鼠疫源地(肃南县)MLVA基因型有1-38型。见表3

图2 甘肃省鼠疫菌MLVA基因类群地区分布图
注:甘肃省1∶ 25万矢量化镇(乡)地图由中国CDC提供。由于地图中无法标注加尔乌宗村和马场村, 分别在相应的城镇地图中按照村的具体位置选取一定区域进行标注。
Fig.2 Regional distribution of Yersinia pestis by MLVA in Gansu Province

2.3 甘肃省鼠疫菌VNTR聚类图

采用“ 14+12” 个VNTR位点分析中, 将14个低变异度指标权重设为2, 另外12个指标权重设为1。聚类结果显示, 198株鼠疫菌分为10个群, 对比菌株的分离地点发现, 大部分菌株根据分离地点聚集成为一群, 每个群中菌株可继续分为5-28个不同分支。通过聚类图可以看出, 阿拉善黄鼠疫源地菌株全部聚集为一群。阿克塞县鼠疫菌株主要分为2个群, 分别集中在阿克塞县红柳湾镇当金山群(35/47)和加尔乌宗村群(10/47)。肃北县鼠疫菌主要分为3个群, 分别为党城湾镇马场群(6/57)、党城湾镇群(25/58)和鱼儿红群(21/57)。玉门市菌株(5/6)主要聚集在肃北县鱼儿红群内。夏河县菌株单独成为一群。肃南县菌株主要分为3个群, 分别为大河乡群(14/73)、马蹄乡群(33/73)和康乐乡群(6/73)。见图1和图2。

表3 甘肃省鼠疫菌MLVA类群及地区分布 Tab.3 Genotypes and regional distribution of Yersinia pestis by MLVA in Gansu Province

图1 198株甘肃省鼠疫菌VNTR位点拷贝数聚类图Fig.1 Clustering graph of copy numbers of VNTR loci in 198 strains of Yersinia pestis from Gansu Province

3 讨 论

MLVA方法广泛应用于鼠疫菌基因分型, 但是VNTR位点选择的不同对分子分型和聚类的结果存在一定差别。Pourcel等[8]人选用25个位点将180株鼠疫菌分成61个基因组型, 而且3个生物型分别位于3个主要分支上, 并发现中世纪型菌株存在一定的多态性。Klevytska等[9]采用46个位点对94株鼠疫菌进行分型, 正确反映了古典型、中世纪型、东方型和田鼠型菌株之间的进化关系。Li等[4]从88个鼠疫菌VNTR位点筛选出“ 14+12” 个位点用于快速溯源分析, 提高了基因分型的分辨率, 缩短实验检测的时间和成本。本实验采用的26个位点能够将生态型不同的鼠疫菌区分开, 并呈现明显的区域聚集性特征。

甘肃省鼠疫菌MLVA基因分型与生态型能够很好的吻合, 并且基因分型能够继续细分, 精确到每个菌株的分离地点。会宁县和平川区阿拉善黄鼠疫源地为甘宁黄土高原阿拉善黄鼠疫源地的西南部分, 景观为低山丘陵干草原, 菌株为甘宁黄鼠型, 菌株独自成为一群。甘南高原疫源地的夏河县和祁连山北麓东段区的肃南县均为旱獭疫源地, 景观均为森林高山草甸草原。夏河县菌株为青藏型, 肃南县菌株为祁连型。夏河县菌株聚集成为一群后, 与肃南县菌株聚集在一起, 肃南县菌株根据分离地点继续分为3个群, 每群间菌株没有明显的地理屏障, 菌株VNTR位点重复数有细微差别, 每个群内菌株继续分化, 表明MLVA分型方法分辨率极高, 可用于观察菌株的微遗传进化。阿尔金山疫源地的阿克塞县和大雪山疫源地的肃北县为旱獭疫源地, 景观类型为高山草原。阿克塞县菌株主要为阿尔金型, 肃北县菌株主要为青藏型。阿克塞县菌株分成2个群, 是当金山群和祁连山西段分离的菌株聚集成的加尔乌宗村群, 两群菌株之间地理上接壤, 没有明显的地理屏障。加尔乌宗村群与肃北县党城湾镇马场群的菌株聚集成为大群, 两地地理上接壤, 没有明显的地理屏障, 属于祁连山西段, 菌株之间交流频繁, 适应相应的地理环境成为优势菌株。肃北县的鼠疫菌除马场群外, 还存在党城湾镇群和鱼儿红群。党城湾镇群和鱼儿红群菌株VNTR位点不同, 党城湾镇和鱼儿红之间存在大雪山地理屏障, 使两地菌株成为两个群。玉门市鼠疫疫源地及毗邻的肃南县祁丰乡生境特征与肃北县鱼儿红相同, 且地理位置接壤, 属于同块疫源地, 故菌株都聚集为一群。

甘肃省鼠疫菌遗传特征复杂, 采用MLVA分型方法发现肃南县康乐乡、马蹄乡和大河乡群内均含有肃北县菌株, 而肃北县党城湾镇、鱼儿红内含有肃南县菌株, 肃北县党城湾镇马场群内含有阿克塞县菌株。这种群内菌株交叉存在的结果与DFR、CRISPR分型方法结果一致[10, 11, 12]。不同群内菌株的交叉存在, 表明阿尔金山-祁连山北麓东段疫源地鼠疫菌基因组之间存在交流, 究其原因有待进一步研究。鼠疫菌VNTR位点拷贝数不断变化, 菌株在自然选择压力作用下适应不同生态景观成为某地区的主要基因类群, 从而肃北县和肃南县疫源地菌株存在主要基因类群和次要基因类群。不同基因类群鼠疫菌的存在表明鼠疫在动物间持续流行。相对应处于肃北县与阿克塞县接壤地区的马场, 肃北县和肃南县接壤地区的祁丰乡出现主次基因类群和不同生态型菌株交叉共存, 出现菌株移行重叠现象, 更例证了研究中发现群内菌株交叉存在的现象。同种疫源地出现不同类型的鼠疫菌, 使得菌株溯源复杂多样, 尤其是在人间鼠疫疫情追踪溯源时要予以重视。

MLVA 作为一种分子分型方法, 其具有高分辨率, 可操作性强, 费用较低, 适合推广应用。本次采用MLVA(14+12)方法对198株甘肃省鼠疫菌进行基因分型, 获得准确的鼠疫菌VNTR位点拷贝数本底资料, 为今后鼠疫菌株的追踪溯源提供技术资料, 为研究甘肃省鼠疫疫源地鼠疫菌遗传进化规律奠定基础, 也为今后开展鼠疫菌遗传突变的监测提供依据。

利益冲突:

引用本文格式:郭丽民, 席进孝, 葛亚俊, 等. 甘肃省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及地区分布[J]. 中国人兽共患病学报, 2021, 37(8):715-721. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.087

责任编辑:王晓欢

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