引用本文
任红宇, 王艳晴, 李一楠, 赵娜, 秦天. 102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2021,37(9): 801-807
REN Hong-yu, WANG Yan-qing, LI Yi-nan, ZHAO Na, QIN Tian. Analysis of serogroups distribution characteristics and drug resistance spectrum of 102 strains of invasive Streptococcus pneumonia [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2021,37(9): 801-807.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.110
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中国人兽共患病学报
102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析
任红宇, 王艳晴, 李一楠, 赵娜, 秦天
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
通讯作者：秦天,Email: qintian@icdc.cn; ORCID: 0000-0003-4134-5075
收稿日期: 2020-11-25
资助项目: 国家自然科学基金(No.81671985)和十三五国家科技重大专项(No.2018ZX10714-002)联合资助
摘要

目的 了解侵袭性肺炎链球菌菌株血清群/型分布特征和菌株耐药性情况。方法 选用本科室保存的102株侵袭性肺炎链球菌菌株(来自内蒙古、宁夏、四川及辽宁)。合成23种肺炎链球菌血清群/型特异性引物,采用多重PCR方法扩增进行初筛,扩增阳性的用荚膜肿胀方法进行复核验证。并选用24种抗生素进行药物敏感性实验。结果 102株侵袭性肺炎链球菌共分为21个血清群,主要流行血清群/型(株数由高到低)依次为19、6、14、23、35/42、34、3、22A、15、1、18、4、5、7B、8、10A、11A、13、17A、20、33F。含10株以上的是19群、6群、14群 。24种抗生素中,莫西沙星、吉米沙星、头孢曲松、多西环素未发现耐药菌株。其余20种抗生素均有耐药菌株出现。耐药率大于90%的抗生素从高到低依次为:阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素;耐药率小于10%的依次为:万古霉素、青霉素(注射)、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟。结论 我国侵袭性肺炎链球菌分离株以19群、6群、14群最多见;23价肺炎疫苗覆盖血清群但不包含的血清型(6A、6C、6D、15C、23B、22A、18A、7B、17A)和非疫苗相关的13群、34群、35/42群也占有一定比例。治疗由肺炎链球菌引起的感染首选吉米沙星、莫西沙星、头孢曲松、多西环素等抗生素。

关键词: 侵袭性肺炎链球菌; 血清群/型; 抗生素耐药性; 非疫苗相关血清群/型
中图分类号:R378.1+4 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2021)09-0801-07
Analysis of serogroups distribution characteristics and drug resistance spectrum of 102 strains of invasive Streptococcus pneumonia
REN Hong-yu, WANG Yan-qing, LI Yi-nan, ZHAO Na, QIN Tian
State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for CommunicableDisease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Qin Tian,Email: qintian@icdc.cn
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81671985),the National Science and Technology Major Projects in the 13th Five-Year Plan(No.2018ZX10714-002)
Abstract

To investigate the serogroup/type distribution and drug resistance of invasive Streptococcus pneumoniae. A total of 102 strains of invasive Streptococcus pneumoniae reserved in our own department were selected (including Neimeng, Ningxia, Sichuan and Liaoning Province). 23 serogroup/type specific primers of Streptococcus pneumoniae were synthesized, multiplex PCR method was used for screening, and capsule swelling method was used for verying the positive results; If the negative was not included in the amplification range, the typed serum was used for the identification of the capsular swelling test directly. 24 kinds of antibiotics were used for sensitivity test. 102 strains of invasive Streptococcus pneumoniae were divided into 21 serotypes, serogroup 19, 6, 14, 23, 35/42, 34, 3, 22A, 15, 1, 18, 4, 5, 7B, 8, 10A, 11A, 13, 17A, 20, 33F(number of strains from high to low) were the main prevalent serotypes. Strain number more than 10 were serogroup 19, 6, and 14. Among 24 antibiotics, no drug-resistant strains were found for moxifloxacin, gemifloxacin, ceftriaxone, and doxycycline. The other 20 antibiotics all have drug-resistant strains. The antibiotics with a resistance rate of more than 90% were azithromycin, dirithromycin, clarithromycin, and erythromycin(from high to low); The resistance rate of less than 10% were vancomycin, penicillin (injection), linezolid, meropenem, rifampicin, levofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, cefepime. In our country, the most common isolates of invasive Streptococcus pneumoniae were serogroup 19, 6, and 14; the serotypes in the vaccine-covered serogroups including 6A, 6C, 6D, 15C, 23B, 22A, 18A, 7B, 17A and non-Vaccine-related serogroup13, 34 and 35/42 accounted for a certain proportion. gemifloxacin, moxifloxacin, ceftriaxone, and doxycycline were first choice for the treatment of infections caused by Streptococcus pneumonia.

Key words: invasive Streptococcus pneumoniae; serogroup/type; antibiotic resistance; non-vaccination-associated serogroup/type

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia, Sp)所致肺炎是社区获得性肺炎之一, 占社区获得性肺炎的15%, 致死率可达25%[1, 2, 3]。轻者导致细菌性肺炎, 严重时可发展为菌血症和细菌性脑膜炎[4]。全球范围内, 每年估计由肺炎链球菌引起的脑膜炎病例大约为32 500例、菌血症637 000例、肺炎2 000万例, 5岁以下儿童死亡原因中, 肺炎占15%[5, 6]。虽然肺炎链球菌可分为46个血清群、90多个血清型, 但只有其中的20多个血清群/型可以导致疾病[7, 8], 要准确鉴定肺炎链球菌的群/型别才能及时确定治疗方案[9]。目前用于预防由这些血清群/型引起的感染有如下几种疫苗:分别是肺炎链球菌23价多糖疫苗(PPV23)、10价结合疫苗(PCV10)、7价结合疫苗(PCV7)、13价结合疫苗(PCV13)[10, 11, 12]。因为疫苗的推广、应用、研发以及抗生素的规范使用是基于临床分离株不断监测的基础上的, 且肺炎球菌的血清群/型会随着时间的推移而变化[13]。因此, 监测侵袭性肺炎链球菌的血清群/型以及耐药谱特性显得尤为重要。本研究以临床患者不同类型样本为实验对象进行血清分群/型, 同时, 对102株侵袭性肺炎链球菌进行24种抗生素敏感性检测, 旨在了解来源于不同标本类型侵袭性肺炎链球菌血清群/型的分布情况以及耐药特性, 从而更好地指导疫苗使用和临床用药。

1 材料与方法
1.1 实验菌株

从中国CDC传染病所呼吸道传染病室菌株库中, 选取2011-2014年分离自临床病人的102株菌株。分别是内蒙古26株(血液分离株22株、胸水分离株4株); 宁夏20株(血液分离株12株、脑脊液分离株6株、胸水分离株1株、穿刺液分离株1株); 四川省19株及辽宁省37株均来自血液分离株。

1.2 主要试剂和仪器

PCR扩增仪为美国 BIO-RADPT-200, 凝胶成像系统为美国Bio-Rad Geldoc XR, TaqDNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNAMarker均购自大连宝生物TaKaRa公司, 超纯水购自美国Gibical公司, DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司, 血清分型试剂盒PNEUMOTEST购自丹麦血清学研究所(Statens Serum Institute, SSI), 显微镜购自日本奥林巴斯公司, 细菌比浊仪购自美国BD公司, 药敏板和全自动药敏分析仪均购自山东鑫科生物科技股份有限公司, 二氧化碳孵箱购自日本三洋公司, PCR引物由诺和公司合成, 细菌生长培养基购自OXICD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 采用PCR方法进行初步鉴定 如下表所示引物序列基于荚膜合成基因簇来控制所有血清群/型荚膜合成, 从而进行不同的血清群/型分型组合[14, 15, 16]。该方法包含8个多重PCR扩增反应, 分别是:①6、3、19A、22A/F; ②8、33F/A/37、15A/15/F、7F/7A/、23A; ③19F、12F/12A/44/46、11A/11D; ④24A/24B/24F、7C/7B/40、4、18、9V/9A; ⑤14、1、23F、15B/15C、10A; ⑥39、10F/10C/、33C、5; ⑦23B、35A/35C/42、34、9N/9L、31; ⑧21、2、20、13。每个多重PCR反应中各包含4~5对分群/型引物以及鉴定肺炎链球菌种的引物CPS。扩增体系是25 μ L/个反应; 扩增条件是95 ℃ 15 min; 94 ℃ 30 s、54 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s (30个循环); 72 ℃ 10 min。将扩增产物于2%琼脂糖凝胶(含DNA染料4 μ L/100 mL, 100 V电泳80 min。同时加100 bp marker以判断结果。未包含在扩增体系中的血清型17A直接进行血清分型。见表1。

表1 肺炎链球菌血清型分型引物序列 Tab.1 Primer sequence for serotyping of Streptococcus pneumoniae

1.3.2 血清分群/型 全部菌株接种于哥伦比亚血琼脂培养基上, 置5% CO2培养箱中培养18 h。用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌, 溶于0.85%的NaCl溶液中, 比浊3.0麦氏单位菌悬液。分别吸取分群/型血清、菌悬液和1%甲基兰溶液各5 μ L于载玻片上, 混合均匀, 盖上盖玻片, 100X油镜下观察试验结果。如果荚膜涨起(菌体自身肿胀)、菌体周围可见边界清晰的无色环状物, 为阳性试验结果。采用该方法对全部分离菌株进行血清分群/型实验[17]。

1.3.3 耐药检测 细菌培养及浓度测定:用棉拭子刮取适量新鲜培养的细菌于细菌稀释液中, 测定和调整比浊值为0.5麦氏单位(Mc Farland)。取50μ L 该细菌菌悬液于12mL药敏接种培养液中进行稀释并混匀, 自动加样器各取100 μ L分别加入药敏培养板各孔。该培养板包括3组抗生素:A组(常规、首选实验的抗菌药物)有红霉素、复方新诺明、克林霉素、青霉素口服、青霉素注射剂、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素; B组(首选实验但选择性报告的抗菌药物)有头孢曲松、美罗培南、头孢噻肟、头孢吡肟、四环素、莫西沙星、左氧氟沙星、万古霉素、多西环素、吉米杀星; C组(替代性或补充性抗菌药物)有利福平、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、利奈唑胺、氯霉素。37 ℃ 5% CO2孵箱孵育18 h判读结果。每次实验分别用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎链球菌ATCC49619对药敏接种培养液做质控、质量检测。

2 结果

2.1 102株侵袭性Sp血清分群/型结果

其中96株(94.12%)通过PCR法鉴定出血清群/型, 6株(5.88%)通过荚膜肿胀实验鉴定出明确的血清群/型。共分成21个血清群, 包括19、6、14、23、35/42、34、3、22、15、1、18、4、5、7、8、10、11、13、17、20、33。尽管其中的18个血清群为23价肺炎链球菌多糖疫苗(PPV23)所覆盖, 但这18个血清群中包含的血清型如6A(3株)、6C(4株)、6D(4株)、15C(1株)、23B(2株)、22A(4株)、18A(1株)、18F(1株)、7B(1株)、17A(1株)未在23价疫苗之列; 另外还有35/42群(6株)、34群(5株)、13群(1株)3个血清群也是23价疫苗没有覆盖到的。23价疫苗以外血清群/型合计33株, 占总株数的32.35%。全部实验用菌株中主要流行血清群依次为(前3位):血清群19(26.47%)、血清群6(17.65%)、血清群14(14.71%), 占总株数的58.83%。且35/42群、34群排在21个血清群中的第5位和第6位。见表2。

表2 102株Sp血清群分布结果 Tab.2 Serogrouping results of 102 Sp strains
2.2 不同标本类型血清分群/型结果

102株菌株来源于血液、脑脊液、胸水和穿刺液4种标本类型。其中90株分离自血液, 分成18个血清群; 另3种类型标本共分离到12株菌株, 鉴定出8个群。见表3。

表3 不同分离部位102株侵袭性SP血清分型结果 Tab.3 Serotyping results of 102 SP strains isolated from different sites
2.3 102株侵袭性Sp耐药结果

耐药率从高到低依次为:阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素、四环素、克林霉素、复方新诺明、头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、头孢塞肟、青霉素(注射)、万古霉素、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、莫西沙星、头孢曲松、多西环素、吉米沙星。耐药率在90%以上的是阿奇霉素、地红霉素、克拉霉素、红霉素; 耐药率在50%以上的是四环素、克林霉素、复方新诺明; 耐药率在10%~50%之间的是头孢呋辛(注射)、头孢呋辛(口服)、青霉素(口服)、氯霉素、头孢塞肟; 耐药率在10%以下的是青霉素(注射)、万古霉素、利奈唑胺、美罗培南、利福平、左氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟; 耐药率为0的是莫西沙星、头孢曲松、多西环素、吉米沙星。见表4。

表4 102株侵袭性Sp对24种抗生素耐药结果 Tab.4 Resistance of 102 invasive Sp strains to 24 antibiotics
3 讨论

肺炎链球菌可经呼吸道进行自体转移, 也可经飞沫、分泌物传播, 主要危害人群为儿童和老年人, 尤其是婴幼儿。在机体免疫力减弱时, 被感染者发生浸润感染, 引起鼻窦炎、肺炎、脑膜炎、中耳炎等严重侵袭性疾病。本研究选用的102株肺炎链球菌分离自临床患者血液、脑脊液、胸水、穿刺液等, 属于侵袭性菌株[18]。 结合EUCAST和临床推荐对24种抗生素进行敏感性检测[19]。3组耐药数据表明, 耐药率< 10%的A组只有青霉素注射剂(5.88%)1种抗生素; B组有吉米沙星(0%)、多西环素(0%)、莫西沙星(0%)、头孢曲松(0%)、头孢吡肟(1.96%)、左氧氟沙星(2.94%)、美罗培南(3.92%)、万古霉素(5.88%) 8种抗生素; C组有利福平(2.94%)、阿莫西林/克拉维酸(1.96%)、利奈唑胺(3.92%)3种抗生素。由此可见, 在治疗由侵袭性Sp引起的感染时上述11种抗生素可以选用。

研究Sp血清分群/型对于合理指导临床用药意义重大, 目前全世界已发现46个血清群, 90 多个血清型, 而其中与肺炎链球菌疫苗相关的仅有20余种[20, 21]。研究102株侵袭性Sp分成21个血清群。其中含10株以上的血清群是19群(27株)、6群(19株)、14群(14株) , 合计60株, 占到总实验株数的58.82%。与高占成等研究结果一致[22]。我们推测上述3个血清群应是我国的优势血清群。

来源于血液标本的菌株分成18个血清群, 来源于脑脊液、胸水等标本的菌株分成8个血清群。不同类型标本血清群不完全相同。血液中分离的血清群以6群、19群和23群为主, 而脑脊液中分离的血清群/型除了包含在血液中分离的血清型别外, 还有如33群、18F血清型、7B血清型等独有的型别。这些血清群/型都不在23价疫苗覆盖范围。此外, 6群19株菌株共分成A、B、C、D 4个血清型, 其中3个血清型(6A、6C、6D)未在23价疫苗覆盖范围之内, 占6群的57.89%(11/19)。另外, 13、34、35/42 血清群也未在疫苗覆盖范围, 它们分别来源于血液的13血清群(1株), 34血清群(4株)、35/42血清群(6株)以及来源于胸水的34血清群(1株)。综上所述, 分离自不同类型标本的血清群/型未完全覆盖在23价疫苗中。所以笔者认为应加大脑脊液、胸水等标本的监测, 以充分了解血清群/型分布及其变化, 为研发新的更多种的疫苗提供数据。

Sp的耐药形势十分严峻, 特别是多重耐药现象。要综合考虑患者病情及其本地区肺炎链球菌血清分布与耐药性情况, 同时, 在条件许可下尽量根据细菌培养与药敏试验结果来合理使用抗生素。尽管中国在2017年引入了PCV13, 但疫苗接种率仍然很低。在我们处理肺炎链球菌引起的感染性疾病时, 应重点关注增加肺炎球菌疫苗的接种率、减少抗生素的不当使用, 有针对性地进行预防。

利益冲突: 无

引用本文格式: 任红宇, 王艳晴, 李一楠, 等.102株侵袭性肺炎链球菌血清型分布特征及耐药谱分析[J].中国人兽共患病学报, 2021, 37(9):801-807.

编辑:张智芳

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