冠状病毒基因组结构相似, 其基因组5'端具有甲基化的帽状结构, 3'端具有poly(A)尾, 基因组含有约7~10个功能基因, 从5'端到3'依次为5'- ORF1a/b - (HE) -S-E-M-N-3'。ORF1ab主要编码病毒的非结构蛋白; 剩下基因区域主要编码病毒的结构蛋白。S、E、M和N基因分别编码冠状病毒的刺突蛋白(Spike Protein, S)、包膜蛋白(Envelop Protein, E)、膜蛋白(Membrane Protein, M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein, N), 另外还有一些β 属冠状病毒编码一种与包膜相关的结构蛋白血凝素酯酶蛋白(Hemagglutinin-esterase Protein, HE)。以PDCoV为例, 病毒的基因组如图1所示。基因组结构的差异是冠状病毒分成不同类群的依据, 针对差异的基因结构设计检测试剂盒可以有效地鉴别不同的冠状病毒。

图1

Fig.1

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	图1 PDCoV的基因组示意图[25]Fig.1 Genome diagram of PDCoV

冠状病毒作为RNA病毒, RT-PCR是检测其最常规的方法, 但只能进行定性检测。实时荧光定量PCR技术通过检测荧光信号强度直接对产物进行定性分析和定量分析, 具有高灵敏度、高特异性和高精准定量等优点。Xiu L团队^[26]针对冠状病毒RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因设计了通用型引物, 建立了一种新的半巢式逆转录RT-PCR方法, 并在81份家禽拭子样品中检出25份冠状病毒阳性; 109份猪拭子样本中检出1份阳性样本; 31份活禽市场气溶胶样本中检出6份阳性样本。除上述通用引物PCR外, 应用最普遍的就是分别针对各种冠状病毒的N^[27]、M^[28]、S^[14]基因保守区域所建立的特异性RT-PCR。

除了上述针对一种冠状病毒的单一RT-PCR外, 多个研究团队还建立了可同时检测2种及以上病原体的双重及多重RT-PCR或实时荧光PCR方法^{[13, 29, 30]}。这在诊断临床混合感染样品及监测疾病中具有较大的优势, 但在引物设计、探针合成方面较为严格。

常见的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)、滚环扩增技术以及依赖解旋酶等温扩增技术等。LAMP技术使用链置换型DNA聚合酶等温扩增, 通过肉眼观察有无白色沉淀即可简单定性, 可在15~60 min内实现109~1 010倍的扩增^[31]。有学者建立了检测IBV的RT-LAMP方法^[32], 对268份不同类型的临床样本进行检测, 平均检出率为98.65%; 另外, 该法用于检测PEDV^[33]、PDCoV^[34]等动物冠状病毒时均显示出较高的灵敏度和特异性。RPA技术是一种依赖于重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在常温条件下5~20 min即可完成的等温扩增技术。也有学者针对PDCoV N基因设计特异引物, 建立了检测PDCoV的RPA方法^[35], 最低检测限度为10³ copies/μ L, 且检测结果比普通PCR方法更加准确。该技术也成功用于快速检测CCoV^[36]。

基因芯片技术的原理为大量合成的DNA探针有序地固定在芯片载体表面成为基因芯片, 待检样品经过扩增和标记后, 与基因芯片杂交反应, 扫描并分析杂交反应的信号, 即可得到待检样品的基因信息。基因芯片技术减少了传统检测技术中为同时检测多种病原而增加多种引物带来的非特异性反应的发生概率, 对于多种病原混合感染的诊断显示出较大的优势, 推动了基因芯片技术在病原检测方面的应用。

胡靖飞团队^[37]建立了联合检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒A群与猪δ 冠状病毒4种猪肠道病毒的寡核苷酸芯片并进行了临床应用, 可同步快速区分4种仔猪腹泻, 为仔猪腹泻的鉴别诊断和高通量筛查提供了新技术。熊炜研究团队^[38]在大量构建特异克隆的基础上筛选, 制备了可同时检测并区分CCoV、FECV、和FIPV的特异性基因芯片。

冠状病毒具有遗传多样性, 容易发生变异和跨种传播。2020年3月以来, 先后有多个国家报道了多起SARS-CoV-2动物感染疫情, 荷兰、丹麦等国家还出现了人-水貂-人的传播链条^{[39, 40]}, 当冠状病毒出现跨种传播时, 原病毒在新宿主体内是否发生变异从而形成一种新的病毒, 单靠一般检测技术无法进行准确判别, 只能对其基因序列进行测序, 进而分析其基因结构以及构建进化树, 从而进行病毒溯源。

测序技术是指测定基因组DNA分子中每一个碱基的排列顺序, 与数据库比对后进行分类。这项技术几乎可以识别临床上所有病原微生物, 尤其在面对未知病原体检测方面, 不需对病原体进行分离培养, 也不需要依赖已知序列才可设计引物进行扩增和检测。适合于病原体初期识别和病毒溯源, 具有特异性高及准确性好等特点, 但由于检测周期长, 并且对仪器设备和检测人员要求严格, 并不适用于快速大量检测。

纳米PCR可用于检测动物冠状病毒含量较低的样品, 它是在普通PCR的基础上加入具有优良导热性的纳米金颗粒, 可缩短扩增时间, 同时能特异性吸附单链DNA分子, 从而减少非特异性扩增^[41]。Zhu Y等^[30]用纳米RT-PCR和普通RT-PCR同时检测病猪的粪便样本, 两种方法对PEDV的检出率分别为48.2%和45.6%, 且经比较, 纳米RT-PCR的灵敏度是普通RT-PCR的10倍, 检测下限也明显高于后者。

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是近年发展起来的一种核酸绝对定量的检测技术, 其原理可理解为分散成无数个独立反应单元的定量PCR, 从而实现单分子意义上的绝对定量检测, 扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号并采用泊松分布的统计学方法进行分析, 即可计算出原始样本的模板拷贝数^[42]。蓝柯团队开发了用于检测SARS-CoV-2的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR), 检测下限值是RT-PCR的1/500, 且临床总体准确率达到94.3%^[43]。虽然目前dPCR用于动物冠状病毒的诊断仍处于起步阶段, 但其在快速、灵敏和准确定量患畜样品中病毒载量方面具有巨大潜力。