江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析
刘师文, 张艳妮, 肖芳, 周珺, 刘晓庆, 熊英, 吴杨博文, 龚甜
江西省疾病预防控制中心,南昌 330029
通讯作者:龚甜, Email:gong_tian0203048@163.com; ORCID:0000-0002-3069-0845
摘要

目的 对2021年江西省高安市采集的鼠肺样本进行肾综合征出血热汉坦病毒分离鉴定及全基因组序列进行分析。方法 采用Vero-E6细胞分离肾综合征出血热汉坦病毒,采用实时荧光RT-PCR法和直接免疫荧光法对分离株进行鉴定,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,采用CLC、MEGA7.0等软件对基因组序列进行分析。结果 从褐家鼠和罗赛鼠各分离到1株汉城病毒(Seoul orthohantavirus,SEOV),分别命名为GAW30/2021、GAW50/2021。2株分离株的3个基因片段大小相同,每个基因编码区长度一致。分离株S、M、L基因分别含1 773、3 651、6 530个核苷酸,分别编码429、1 133、2 151个氨基酸。2株分离株3个基因核苷酸序列同源性分别为99.7%、99.0%、99.4%、氨基酸序列同源性分别为99.8%、99.7%、99.9%。2株分离株与国内外SEOV参考株全基因组核苷酸同源性为84.3%~94.9%,氨基酸同源性为96.1%~99.8%,在系统进化树上独立分枝。2株分离株与SEOV疫苗株基因组氨基酸同源性为97.6%~99.1%;核蛋白和糖蛋白免疫表位氨基酸序列与疫苗株一致。结论 首次在江西省高安市鼠肺样本中分离到2株SEOV变异株,目前疫苗对变异株仍具有保护力。

关键词: 汉城病毒; 病毒分离与鉴定; 全基因组序列; 疫苗
中图分类号:R373、R512.8 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2022)02-0102-06
Isolation and complete genome sequence analysis of two Seoul orthohantavirus strains isolated from Gaoan City, Jiangxi Province
LIU Shi-wen, ZHANG Yan-ni, XIAO Fang, ZHOU Jun, LIU Xiao-qing, XIONG Ying, WU Yang-bo-wen, GONG Tian
Jiangxi Center for Disease Control and Prevention, Nanchang 330029, China
Corresponding author: Gong Tian, Email: gong_tian0203048@163.com
Abstract

This study aimed to analyze whole genome sequences of Seoul orthohantavirus from rat lung samples collected in Gaoan City, Jiangxi Province in 2021. Vero-E6 cells were used to isolate orthohantavirus; real-time fluorescent RT-PCR and direct immunofluorescence were used to identify the isolates, high-throughput sequencing technology was used to sequence the whole genomes of the isolates, and CLC and MEGA7.0 software were used to analyze the genome sequence. Two strains of SEOV, named GAW30/2021 and GAW50/2021, were isolated from Rattus norvegicus and Rattus rosenbergii, respectively. The three gene fragments of the two strains were the same size, and the length of the coding region of each gene was the same. The S, M and L genes of the isolates contained 1 773, 3 651 and 6 530 nucleotides, encoding 429, 1 133 and 2 151 amino acids, respectively. The S, M and L nucleotide sequence identity of the two isolates was 99.7%, 99.0% and 99.4%, and the amino acid sequence identity was 99.8%, 99.7% and 99.9%, respectively. The two strains shared 84.3%-94.9% nucleotide sequence identity and 96.1%-99.8% amino acid sequence identity with SEOV reference strains. The amino acid sequence identity between the two strains and the SEOV vaccine strain was 97.6%-99.1%. The amino acid sequence of nucleoprotein and glycoprotein epitopes of the two strains was consistent with that of the vaccine strain. This study reports the first isolation of SEOV strains from rat lung samples in Gaoan City, Jiangxi Province, and indicates that the current vaccine still has protective effects against variants.

Key words: Seoul orthohantavirus; virus isolation and identification; complete genome sequence; vaccine

汉坦病毒(Orthohantavirus, HV)是汉坦病毒科, 正汉坦病毒属有包膜、分节段的负链RNA病毒, 啮齿类动物为其自然宿主, 人类通过吸入被HV感染动物的排泄物气溶胶可引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)或汉坦病毒肺综合征[1]。HV在世界范围内流行, 对人类造成了严重危害, HFRS也是中国最严重的鼠传疾病之一[2]。HV病毒基因组分为S、M、L 3个基因片段, 分别编码核衣壳蛋白、糖蛋白前体及RNA依赖的RNA聚合酶。正汉坦病毒属目前有38个种, 在我国流行最广并明确导致肾综合征出血热的种为SEOV和汉滩病毒(Hantaan orthohantavirus, HTNV)。

高安市是江西省历年HFRS发病最严重的区县之一, 从2005年开始开展人间和鼠间HFRS监测, 为国家级HFRS监测点。2011年本实验室基于HV部分M基因测序分析, 发现江西上高(与高安市接壤的县)地区出现了与现有流行SEOV株基因序列差异较大, 在基因进化树上独立分支的SEOV(SG42/2011株)[3], 后续在高安市持续监测到与之高度同源的病毒(GAN44/2014、GANS49/2015株等)[4]。因为前期获得的基因序列信息仅为M基因片段(长400 bp左右), 对流行株整体变异情况、基因组与疫苗株匹配程度等无法进行更深入的分析, 所以本实验室重点对高安市鼠类样本开展HV病毒分离和全基因组测序研究, 以期更深入了解高安市流行的SEOV变异株遗传变异信息, 为HFRS防控提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 样本

收集2021年江西省高安市鼠肺标本62份, 经实时荧光RT-PCR法检测有6份HV阳性, 2份SEOV 和4份HTNV, 对6份HV核酸阳性样本进行病毒分离。

1.2 主要试剂和仪器

Vero-E6细胞、小牛血清、胎牛血清、MEM、细胞刮刀、荧光素标记的汉坦病毒抗体与文献[5]相同, 高通量测序仪ABI Ion Gene Studio S5及测序试剂 (赛默飞)、倒置显微镜和荧光显微镜(尼康), 组织破碎仪(美国Next Advance)。

1.3 病毒分离及鉴定

采用灭菌手术剪剪下HV核酸阳性鼠肺至1.5 mL离心管中, 加入适量无菌1× PBS溶液, 离心管盖好放至组织破碎仪粉碎, 制成10%鼠肺样本悬液。用封口膜封住离心管口防止离心管盖弹开。悬液经6 000 g, 4 ℃离心10 min后, 取上清0.8~1 mL接种长成75%单层的Vero-E6细胞。37 ℃吸附2 h; 吸去残留液体加入含2%牛血清的MEM维持液, 37 ℃培养。每7 d更换1次维持液, 28 d传代1次, 传代方法按照细胞传代方式进行。

1.4 培养物鉴定

分别在每次换液前吸取培养物上清进行核酸提取, 采用实时荧光RT-PCR检测HV核酸, 方法参照文献[6]。当实时荧光RT-PCR法检测 Ct值出现明显降低且低于22时, 用刮刀刮取少量细胞涂片进行直接免疫荧光检测。抗原片制备及直接免疫荧光检测方法参照文献[5], 抗原片出现特异性绿色荧光说明病毒分离成功。若连续传代3次未检出HV则分离结果为阴性。

1.5 鼠种鉴定

采用PCR方法扩增鼠肺样本中鼠线粒体细胞色素氧化酶基因(cytb)并测序, 序列通过NCBI Blast比对确定鼠种, 引物和扩增方法参照文献[7]。

1.6 分离株全基因组序列测定和分析

采用ABI Ion Gene Studio S5高通量测序仪对分离株核酸进行全基因组序列测定, 采用CLC软件对测序仪数据分析获得全基因组序列, 从GenBank下载HV参考株全基因序列, 采用MEGA7.0、DNASatar等软件对基因序列进行比对分析, 以最大似然法构建HV系统进化树(参考株序列信息见表1)。将分离株基因组序列与疫苗株基因组以及文献发表的HV B细胞和T细胞免疫表位进行比对分析, 从基因层面分析疫苗保护效果。

表1 进化分析所用参考株的序列信息 Tab.1 Sequence information on reference strains used in evolutionary analysis
2 结果
2.1 实时荧光RT-PCR法检测培养物上清

每次换液前吸取培养物上清进行核酸提取, 经荧光RT-PCR检测发现, 2份样本(GAW30/2021, GAW50/2021, 均为SEOV型)随着时间推移荧光Ct值明显降低。GAW30/2021, GAW50/2021培养物上清荧光RT-PCR检测扩增曲线图见图1、图2。GAW30/2021随着时间推移荧光强度逐渐增强, Ct值逐渐降低。GAW50/2021培养物核酸在21 d前荧光强度和Ct值变化不大, 而在第28 d Ct值发生明显变化。其余4份阳性样本培养物培养至3代, 经荧光RT-PCR检测仍无特异性荧光信号, 病毒分离结果为阴性。

图1 GAW30/2021培养物上清荧光RT-PCR检测图Fig.1 Real-time RT-PCR detection map of GAW30/2021 culture supernatants on the indicated days

图2 GAW50/2021培养物上清荧光RT-PCR检测图Fig.2 Real-time RT-PCR detection of GAW50/2021 culture supernatants on the indicated days

2.2 直接免疫荧光检测

分别在接种后28 d、35 d(第2代第7 d)刮取少量GAW30/2021、GAW50/2021细胞制备抗原片, 采用直接免疫荧光方法检测细胞内病毒颗粒(图3)。GAW30/2021、GAW50/2021分别在接种后28 d、35 d, 大多数细胞内均可见到特异性绿色荧光颗粒。

图3 Vero-E6细胞培养物直接免疫荧光试验图(20倍)
注:A为GAW30/2021培养物(28 d), B为GAW50/2021(35 d), C为Vero-E6细胞对照。
Fig.3 Direct immunofluorescence testing of Vero-E6 cell cultures (20 times)

2.3 鼠种鉴定

扩增GAW30/2021、GAW50/2021鼠肺样本中鼠cytb基因并测序, 获得两条长411 bp鼠cytb基因序列, 上传至GenBank, 登录号分别为:MZ420337、MZ420336。 通过NCBI Blast比对确定, GAW30/2021鼠种为褐家鼠, GAW50/2021鼠种为黄毛鼠(也称罗赛鼠)。

2.4 基因组序列分析

经高通量测序获得分离株GAW30/2021、GAW50/2021基因组序列, 2株分离株的3个基因片段大小相同, 每个基因编码区长度一致。S、M、L基因分别含1 773、3 651、6 530个核苷酸, 分别编码429、1 133、2 151个氨基酸, 核苷酸序列同源性分别为99.7%、99.0%、99.4%、氨基酸序列同源性分别为99.8%、99.7%、99.9%。分离株基因序列详细信息可登录NCBI网站, GenBank登录号:MZ504237-MZ504242。

以最大似然法构建的系统进化树(图4、5、6), 其中SEOV 参考株S、M、L基因序列分别为21条、17条、11条, HTNV参考株为76-118株, 本研究中的序列用黑圆形标志。图中括号内为相应参考株基因序列的GenBank登录号。由图可见, 分离株GAW30/2021、GAW50/2021 S、M、L基因进化树上都分布在SEOV进化枝, 与SEOV参考株遗传距离较远, 呈独立分枝。

图4 汉坦病毒HV S基因核苷酸系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of orthohantavirus based on the S segment

图5 汉坦病毒 M基因核苷酸系统进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of orthohantavirus based on the M segment

图6 汉坦病毒 L基因核苷酸系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of orthohantavirus based on the L segment

GAW30/2021、GAW50/2021 与21株SEOV 参考株S基因编码区核苷酸同源性为88.8%~94.9%, 氨基酸同源性为97.7%~99.8%, 与江西上高SG42/2011株关系最近; 与HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性均为73.3%, 氨基酸同源性分别为84.2%、84.5%; 与17株SEOV 参考株M基因编码区核苷酸同源性为84.3%~87.2%, 氨基酸同源性为96.1%~98.3%, 与HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性分别为71.9%, 72.0%, 氨基酸同源性分别为77.4%、77.6%; 与11株SEOV 参考株L基因编码区核苷酸同源性为84.3%~84.6%, 氨基酸同源性为97.2%~97.8%, 与HTNV 76-118株的L基因核苷酸同源性均为75.1%, 氨基酸同源性均为85.4%。

GAW30/2021株与SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分别为89.7%、84.9%, 84.6%, 氨基酸同源性分别为98.8%、96.9%、97.6%, 氨基酸变异位点数分别为5个、35个、51个; GAW50/2021株与SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分别为89.5%、84.9%, 84.7%, 氨基酸同源性分别为99.1%、97.0%、97.7%, 氨基酸变异为位点数分别为4个、34个、49个。

2.5 核蛋白和糖蛋白免疫表位氨基酸变异位点分析

将分离株S和M基因推导氨基酸序列与已发表的文献[8, 9, 10, 11, 12]中关于SEOV 核蛋白和糖蛋白上的免疫表位比较, 分析分离株在免疫表位上氨基酸的变异情况。结果分离株核蛋白4 个免疫表位:72GKNIGQDRDPTGVEPGDHLKERSALSYGNTL-DLNSLDID110165YEDVNGIRKP174251PIAGSLSGNPVNRD264338MRNTIMASK346均未发生氨基酸改变。Z37疫苗株与GAW30/2021、GAW50/2021株糖蛋白2个免疫表位(435GQKKTILTKTLVIGQ451880PFSCPEFGQFRKKC894)中氨基酸序列一致。

3 讨 论

HV病毒分离是HV病原学研究非常重要的技术手段, 该病毒分离技术早在20世纪80年代就已建立, 在可分离的病毒中HV属于较难分离的病毒[13]。因为对样本要求高, 分离周期长, 病毒分离率低等原因, HV病毒分离技术应用得越来越少。中国现阶段使用的HFRS疫苗毒株主要为20世纪80年代分离, 随着病毒的变异, 存在现有疫苗对流行株缺乏免疫保护作用的风险。开展病毒分离, 储备新的HV毒株, 对开展流行毒株的抗原性及疫苗保护效能研究、指导HFRS疫情防控有非常重要的意义。

本研究从江西省HFRS重点疫区高安市分离到2株SEOV, 2株分离株与国内外SEOV参考株全基因组核苷酸差异较大, 同源性为84.3%~94.9%, 氨基酸同源性为96.1%~99.8%, 在系统进化树上独立分枝, 证实了高安市鼠间流行的SEOV基因组发生了较大变异。目前尚未在人间HFRS疫情中发现该病毒, 后期应加强人间疫情的监测。成功分离2株SEOV变异株, 丰富了我国SEOV毒种的基因型别。

接种疫苗是预防HFRS最有效的手段。2株分离株与SEOV疫苗株Z37 基因组核苷酸差异较大, 同源性为84.6%~89.7%, 但氨基酸同源性仍较高, 为97.6%~99.1%; 核蛋白和糖蛋白的免疫表位氨基酸序列与Z37一致。因此, 推断流行株虽然发生了较大变异, 但是目前疫苗对流行株仍具有保护力, 还应当持续监测病毒变异情况。

HV不同种病毒通常有稳定的宿主, 如HTNV宿主主要是黑线姬鼠, SEOV宿主主要为褐家鼠[14]。本研究现场采样时, 将GAW50/2021鼠种定为臭鼩鼱, 通过鼠cytb基因检测, 确定GAW50/2021鼠种为黄毛鼠(也称罗赛鼠)。因此, 我们认为仅依靠鼠种外形特征以及采样人员的经验判断鼠种, 容易产生误差。在确定病毒来源物种时, 尤其是在得出“ 宿主溢出” [15]“ 宿主转换” [16]结论时应结合分子生物方法对鼠种进行鉴定。

本研究成功分离到2株SEOV变异株, 丰富了我国SEOV毒种的基因型别, 经全基因序列分析, 推断目前疫苗对变异株仍具有保护力, 为HFRS防控提供科学依据。

利益冲突:

引用本文格式: 刘师文, 张艳妮, 肖芳, 等. 江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2022, 38(2):102-107. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.023

参考文献
[1] Diagne MM, Dieng I, Granjon L, et al. Seoul orthohantavirus in wild black rats, Senegal, 2012-2013[J]. Emerg Infect Dis, 2020, 26(10): 2460-2464. DOI: 10.3201/eid2610.201306 [本文引用:1]
[2] Zhang YZ, Zou Y, Fu ZF, Plyusnin A. Hantavirus infections in humans and animals, China[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(8): 1195-1203. DOI: 10.3201/eid1608.090470 [本文引用:1]
[3] 刘师文, 徐刚, 龚甜, . 江西省鼠类携带汉坦病毒基因特征研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(5): 475-479. DOI: 10.11853/j.issn.1003.4692.2015.05.011 [本文引用:1]
[4] 刘师文, 龚甜, 徐刚, . 2012-2015年江西省啮齿动物间流行的汉坦病毒基因型和基因亚型分析[J]. 现代预防医学, 2018, 45(6): 1090-1094. [本文引用:1]
[5] 刘师文, 徐刚, 施勇, . 江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(12): 1157-1162. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.014 [本文引用:2]
[6] 刘师文, 熊英, 施勇. 一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国人兽共患病学报, 2021, 37(6): 61-66. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.067 [本文引用:1]
[7] Smith M F, Patton J L. Variation in mitochondrial cytochrome b sequence in natural populations of South American akodontine rodents (Muridae: Sigmodontinae)[J]. Mol Biol Evol, 1991, 8(1): 85-103. DOI: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040638 [本文引用:1]
[8] Liang M, Mahler M, Koch J, et al. Generation of an HFRS patient-derived neutralizing recombinant antibody to Hantaan virus G1 protein and definition of the neutralizing domain[J]. J Med Virol, 2003, 69(1): 99-107. DOI: 10.1002/jmv.10259 [本文引用:1]
[9] Okumura M, Yoshimatsu K, Araki K, et al. Epitope analysis of monoclonal antibody E5/G6, which binds to a linear epitope in the nucleocapsidprotein of hantaviruses[J]. Arch Virol, 2004, 149(12): 2427-2434. DOI: 10.1007/s00705-004-0393-9 [本文引用:1]
[10] Yan G, Zhang Y, Ma Y, et al. Identification of a novel B-cell epitope of Hantaan virus glycoprotein recognized by neutralizing 3D8 monoclonal antibody[J]. J Gen Virol, 2012, 93(12): 2595-2600. [本文引用:1]
[11] Sankar S, Ramamurthy M, Nand agopal B, et al. Short peptide epitope design from hantaviruses causing HFRS[J]. Bioinformation, 2017, 13(7): 231-236. DOI: 10.6026/97320630013231 [本文引用:1]
[12] Conte F, Tinoco BC, Chaves TS, et al. Identification and validation of specific B-cell epitopes of hantaviruses associated to hemorrhagic fever and renal syndrome[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2019, 13(12): 1-15. DOI: 10.1371/journal.pntd.0007915 [本文引用:1]
[13] Juto P, Elgh F, Ahlm C, et al. The first human isolate of Puumala virus in Scand inavia as cultured from phytohemagglutininstimulated leucocytes[J]. J Med Virol, 1997, 53(2): 150-156. DOI: 10.1002/(sici)1096-9071(199710)53:2<150::aid-jmv7>3.0.co;2-8 [本文引用:1]
[14] Jiang H, Zheng XY, Bai XH, et al. Hantavirus infection: a global zoonotic challenge[J]. Virol Sin, 2017, 32(1): 32-43. DOI: 10.1007/s12250-016-3899-x [本文引用:1]
[15] 姚苹苹, 陈钢, 徐芳, . 浙江省天台县2011-2018年汉坦病毒基因型别和进化变异研究[J]. 中华流行病学杂志, 2019, 40(10): 1285-1290. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2019.10.021 [本文引用:1]
[16] 王慎骄, 王笑辰, 朱小娟, . 江苏省2009-2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2015, 35(11): 1564-1571. [本文引用:1]