引用本文
聂守民, 罗波艳, 孙养信, 范锁平, 常文辉, 孙杰, 安翠红. 陕西省鼠疫耶尔森菌间区规律短回文重复序列基因分型研究及流行病学分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2022,38(2): 182-186
NIE Shou-min, LUO Bo-yan, SUN Yang-xin, FAN Suo-ping, CHANG Wen-hui, SUN jie, AN Cui-hong. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats genotyping and epidemiological analysis of Yersinia pestis in Shaanxi Province [J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2022,38(2): 182-186.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.018
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中国人兽共患病学报
陕西省鼠疫耶尔森菌间区规律短回文重复序列基因分型研究及流行病学分析
聂守民1, 罗波艳1, 孙养信1, 范锁平1, 常文辉1, 孙杰2, 安翠红1
1.陕西省疾病预防控制中心,西安 710054
2.澄城县疾病预防控制中心,澄城 715200
通讯作者:安翠红,Email:an_ch@163.com; ORCID:0000-0002-4224-8683
收稿日期: 2021-01-28
资助项目: 陕西省重点研发计划项目(No.2018SF-001)
摘要

目的 通过CRISPR(间区规律短回文重复序列)对陕西省鼠疫菌进行基因分型,分析流行病学特征,为陕西省鼠疫防治工作提供科学依据。方法 提取分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫菌核酸,利用针对鼠疫菌的3对CRISPR引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序及分析,确定CRISPR基因分型。结果 66株鼠疫菌在3个位点上共有12种spacer,其中YPa 3种、YPb 5种、YPc 4种,具体为al'、a2'、a3'、b1'、b2'、b29'、b1″、b2″、c1、c2、c3、c3',基因簇为Cb2',基因型分为1'和4'两种。结论 疫情发生年份不同,鼠疫菌CRISPR基因型不同,鼠疫疫情处置进行溯源应将生态分型与基因分型结合。

关键词: 陕西; 鼠疫菌; 间区规律短回文重复序列(CRISPR); 流行病学
中图分类号:R516.8 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2022)02-0182-05
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats genotyping and epidemiological analysis of Yersinia pestis in Shaanxi Province
NIE Shou-min1, LUO Bo-yan1, SUN Yang-xin1, FAN Suo-ping1, CHANG Wen-hui1, SUN jie2, AN Cui-hong1
1. Center for Disease Control and Prevention of Shaanxi Province, Xi̓an 710054, China
2. Center for Disease Control and Prevention of Chengcheng, Weinan 715200, China
Corresponding author: An Cui-hong, Email:an_ch@163.com
Abstract

This study aimed to analyze the genotypes and epidemiological characteristics of Yersinia pestis by using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), to provide a scientific basis for plague prevention and control in Shaanxi Province. DNA was extracted from 66 strains of Yersinia pestis isolated from Shaanxi Province, by using three pairs of CRISPR primers for PCR amplification. The CRISPR genotypes of the strains were determined through cluster analysis in BioNumerics software. Twelve spacers based on three CRISPR loci (three for YPa(al', a2', a3',), five for YPb (b1', b2', b29', b1″, b2″,)and four of YPc(c1, c2, c3 and c3) ) were found from the 66 strains of Yersinia pestis. All pathogens were divided into one CRISPR gene cluster (Cb2￠) and two genotypes (1' and 4'). The CRISPR genotypes of Yersinia pestis differed among epidemic years. Therefore, ecological typing and genotyping should be combined to trace the origin of the plague epidemic.

Key words: Shaanxi; Yersinia pestis; clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR); epidemiology

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的一种传染性强、病死率高的烈性传染病, 是我国法定的甲类1号传染病[1]。陕西省鼠疫疫源地位于榆林市定边县, 1987年5月被判定为鼠疫疫源地, 为鄂尔多斯高原长爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年先后发生3次动物间鼠疫流行。

CRISPR(间区规律短回文重复序列)是存在于细菌等原核生物基因中的能够抵御外源DNA入侵的重复序列, 因此也是一种免疫系统[2]。CRISPR由前导区(Leader)、正向重复序列区(Repeat)和间隔区(Spacer)组成, 结构稳定。前导区种内保守, 种间差异显著; 正向重复序列被间隔序列隔开形成一种重复, 间隔序列的排布具有种群对应关系[3, 4, 5]。CRISPR技术简便而且实用, 在很多领域得到广泛应用。鼠疫菌基因中存在3个重复保守的CRISPR位点, 利用这3个位点可对鼠疫菌进行基因分型及进化研究[6]。Cui等[7]利用CRISPR技术将我国分离自不同类型自然疫源地的鼠疫菌进行了基因分型, 为我国更好的开展鼠疫菌CRISPR分型工作起到了极大的推动作用。为明确陕西省鼠疫菌基因分型及流行病学特征, 对本省3次动物间鼠疫流行期间分离的66株鼠疫菌进行了CRISPR分型工作。

1 材料与方法
1.1 鼠疫菌菌株

66株鼠疫菌分离自1987-1988年、2000-2001年、2006年在陕西省定边县发生的3次动物间鼠疫流行期间(表3)。

1.2 仪器设备

高速离心机, PCR扩增仪, 水平电泳仪, 凝胶成像仪, 移液器。

1.3 试剂耗材

超纯水; 2× PCR扩增混合液(Taq Mix, 全式金生物技术有限公司); 琼脂糖; 5× TBE电泳缓冲液; DNA染料; DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker, 全式金生物技术有限公司)。

1.4 3对引物

参照文献[8]设计3对CRISPR位点引物:YPa、YPb、YPc序列见表1, 由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表1 CRISPR引物名称及序列 Tab.1 Primer names and sequences of CRISPR
1.5 PCR方法

30 μ L体系:2× PCR Supermix 15 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物各0.5 μ L, 20 ng/μ L DNA模板1 μ L, 超纯水13 μ L。扩增程序:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 40 s, 58 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min。

1.6 基因测序

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确定后送北京睿博兴科生物技术有限公司进行基因双向测序, 获得拼接序列。

1.7 数据分析

进入http://minisatellites.u-psud.fr/, 点击“ CRISPRfinder” , 输入拼接序列后点击“ FinderCRISPR” 得到DR序列与Spacer序列的结果。根据Cui等[7]的方法进行命名及分型, 将结果汇总至Excel进行分析。

2 结果
2.1 间隔序列及阵列结果

陕西省分离的66株鼠疫菌的间隔序列为12种:al'、a2'、a3'、b1'、b2'、b29'、b1″、b2″、c1、c2、c3、c3'(表2); 阵列结果为5种:YPa位点:al'-a2'-a3', YPb位点:b1'-b2'-b29'、b1″-b2″, YPc位点:c1-c2-c3、c1-c2-c3'(表3)。

表2 12个间隔序列碱基序列 Tab.2 Sequences of the 12 spacers
2.2 CRISPR分型结果

66株鼠疫菌为2个基因型:1'(a1'-a2'-a3'-b1″-b2″-c1-c2-c3)和4'(a1'-a2'-a3'-b1'-b2'-b29'-c1-c2-c3'), 24株菌为1', 42株菌为4'(表3)。

表3 宿主、媒介信息及CRISPR基因分型结果 Tab.3 Host and vector information and CRISPR genotyping results
2.3 分离菌株比对结果

66株菌的分离宿主及媒介包括长爪沙鼠、三趾跳鼠、荒漠毛庶鼠、黑线仓鼠、秃病蚤蒙冀亚种、同形客蚤、二齿新蚤等。CRISPR结果显示, 陕西省菌株的间隔序列没有出现新序列, 但本研究所获得间隔序列除c1、c2、c3、c3'有文献[8]记载外, al'、a2'、a3'、b1'、b2'、b29'、b1″、b2″均无文献报道。al'、a2'、a3'比al、a2、a3序列缺少后面T碱基, b1'比b1缺少前面T碱基, b1″与b1比缺少前面TC碱基, 与b1'比缺少C碱基, b2'与b2比缺少前面G碱基, b2″与b2比缺少前面AG碱基, 与b2'比缺少前面A碱基, b29'与b29比缺少前面A碱基, 可以认为前者是后者的变异体[17]。66株鼠疫菌Ypa序列均为al'-a2'-a3', YPb 序列分为2种, 为b1'-b2'-b29'和b1″-b2″2种, YPc 序列分为2种, c1-c2-c3和c1-c2-c3', 且YPb 序列b1'-b2'-b29'和c1-c2-c3'组合, b1″-b2″和c1-c2-c3组合。

1987-1988年流行年份, 检测10株菌, 其中7株为a1'-a2'-a3'-b1″-b2″-c1-c2-c3, 来自长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种及同形客蚤, 3株为a1'-a2'-a3'-b1'-b2'-b29'-c1-c2-c3', 均来自长爪沙鼠; 2000-2001年流行年份, 检测41株菌, 其中39株为a1'-a2'-a3'-b1'-b2'-b29'-c1-c2-c3', 长爪沙鼠、黑线仓鼠、秃病蚤蒙冀亚种、二齿新蚤、荒漠毛庶鼠、三趾跳鼠, 2株为a1'-a2-'a3'-b1″-b2″-c1-c2-c3, 来自长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种; 2006流行年份, 检测15株菌, 全为a1'-a2'-a3'-b1″-b2″-c1-c2-c3, 长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种及同形客蚤。不同年份, 主导的基因型不同, 1987-1988年、2000-2001年流行年份, 2种基因型都有, 1987-1988年, 2006年以基因型1'为主, 2000-2001年以基因型4'为主。

2.4 流行病学特征分析

登录中国疾病预防控制信息系统的鼠疫防治管理信息系统, 汇总2005-2020年的鼠疫监测数据, 并与2005年之前的留存资料进行鼠种及媒介种类的比较, 发现定边县鼠疫自然疫源地多年来的优势鼠种及主要媒介种类并没有发生变化, 说明生态环境一直保持在动态平衡中。每年度的监测数据只在鼠密度和蚤指数上进行波动, 这2个指标对动物间鼠疫的发生有很好的指示作用。本研究的3次动物间鼠疫流行, 菌株的优势基因型别有所不同, 定边鼠疫自然疫源地自2006年后未再发生鼠间疫情也未再分离到鼠疫菌株, 所以菌株基因型别是否会再发生变化有待验证。2005-2020年鼠疫监测数据详见表4。

表4 2005-2020年定边县鼠疫疫源地鼠种及媒介种类变化 Tab.4 Changes in host and vector species in Dingbian from 2005 to 2020
3 讨 论

陕西省鼠疫疫源地属于长爪沙鼠疫源地的一部分, 分布于榆林市定边县, 该县地处陕西省西北角, 是黄土高原与内蒙古鄂尔多斯荒漠草原过渡地带, 系陕、甘、宁、蒙四省区交界地, 1987-2006年发生过3起动物鼠疫疫情, 流行鼠疫菌生态型为鄂尔多斯高原型[9, 10], 与内蒙古、河北长爪沙鼠鼠疫菌生态型一致。内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地近2年比较活跃, 2019年、2020年该疫源地先后出现了人间鼠疫病例, 陕西鼠疫疫源地加强监测外, 开展对历次流行鼠疫菌基因分析和流行病学深入研究有重要意义。

CRISPR(间区规律短回文重复序列)作为一种实用且简便的基因分型技术, 在鼠疫研究领域也得到了应用。国内, Cui等[7]利用CRISPR技术将我国鼠疫菌定为37种基因型, 杨光璨等[11]利用该技术对云南省鼠疫菌进行了分型研究, 贺金荣等[12]对新疆鼠疫菌也进行了CRISPR基因分型研究, 甘肃省、四川省和河北省也相继对本省鼠疫菌进行了分型研究[13, 14, 15]; 国外, Riehm等[16]利用CRISPR及MLVA技术对马达加斯加的鼠疫分离菌株进行了基因分型, Barros等[17]研究了CRISPR基因座在鼠疫菌微进化过程中的动态。随着现代分子生物学的发展, 已有越来越多的技术用于鼠疫菌的基因分型及溯源方面, 差异片段分析(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列分析(CRISPR)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)、单核苷酸多态性分析(SNP)、脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)、插入序列分析(IS)等。目前CRISPR技术在鼠疫菌基因分型研究中的应用已经淡化, 可能原因是鼠疫菌存在的自然环境相对比较稳定, 菌株、噬菌体等外源性DNA及生态环境处于一种相对稳定的平衡状态, 所以CRISPR位点较难发生变化, 而MLVA技术因其在众多分型技术当中具有很高的分辨性并且结果重复性也很稳定, 已经越来越多应用到鼠疫菌的基因分型当中[18, 19, 20]。本文选用CRISPR基因分型技术, 旨在建立陕西省鼠疫菌的基因数据库, 掌握66株鼠疫菌分离株的基因特征并与已报道的长爪沙鼠疫源地的鼠疫菌分离株的CRISPR结果进行比较, 为陕西省更好地防控鼠疫提供科学依据。

长爪沙鼠疫源地是内蒙古乃至全国动物疫情最为活跃的地区之一, 一种生态型可以有不同的基因型[23], 本研究结果显示, 陕西省鼠疫菌CRISPR分型与内蒙古鄂尔多斯高原长爪沙鼠疫源地鼠疫菌基因型相一致[21], 但不完全一样, 发现了al'、a2'、a3'、b1'、b2'、b29'、b1″及b2″8种变异体, 提示疫情处置应将生态分型与基因分型的联合应用可以更好地对疫情进行溯源。目前, 这8种变异体在已发表的内蒙古鄂尔多斯高原长爪沙鼠疫源地鼠疫菌CRISPR基因分型并未出现, 其他阵列结果与内蒙古鄂尔多斯高原长爪沙鼠疫源地鼠疫菌结果完全一致, 变异体是否为陕西省特有有待进一步的验证。陕西省第1次动物间鼠疫流行期间, 虽然只分离到10株菌, 但包含了2种基因型(1'和4', 以1'基因型为主)、12种间隔序列; 第2次流行期间分离得到41株菌, 以基因型4'为主, 仅有2株菌为基因型1'; 第3次流行期间分离得到15株菌, 全部为基因型1', 说明3次动物间鼠疫是相互独立的事件并不是疫情的延续, 同时也说明2种基因型是交替活跃的, 可能与当时的生态环境有关系。本研究在媒介分离得到的菌株基因型别与宿主分离得到的型别相一致。长爪沙鼠疫源地包括陕西、河北、内蒙古、宁夏、山西等疫源地, 该疫源地面积大, 北与蒙古、俄罗斯接壤, 不同地区之间存在宿主及媒介之间的交流, 容易导致输入性疫情的发生并且还会使鼠疫耶尔森菌发生基因突变。长爪沙鼠疫源地内带菌宿主与媒介种类繁多, 长爪沙鼠作为主要宿主其繁殖能力强, 鼠密度常年居高不下; 跳蚤作为鼠疫传播的主要媒介其种类较多、数量巨大, 为鼠疫耶尔森菌在自然界中的保存与传播及菌株变异都提供了便利条件。

本研究确定了陕西省鼠疫疫源地鼠疫菌的CRISPR基因型, 丰富了长爪沙鼠鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌分离菌株的基因型, 为进一步做好陕西鼠疫防控工作提供了科学依据。

利益冲突: 无

引用本文格式: 聂守民, 罗波艳, 孙养信, 等. 陕西省鼠疫耶尔森菌间区规律短回文重复序列基因分型研究及流行病学分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2022, 38(2):182-186. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.018

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