引用本文
董晓庆, 石利民, 王雅倩, 何敏, 丁松宁, 张守刚. 南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2022,38(4): 322-326
DONG Xiao-qing, SHI Li-min, WANG Ya-qian, HE Min, DING Song-ning, ZHANG Shou-gang. Serological detection and genotype analysis of Hantavirus isolated from patients with suspected hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in the Nanjing metropolitan area[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2022,38(4): 322-326.  
Doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.037
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中国人兽共患病学报
南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析
董晓庆, 石利民, 王雅倩, 何敏, 丁松宁, 张守刚
南京市疾病预防控制中心,南京 210003
通信作者：张守刚, Email: shougang200716@njmu.edu.cn; ORCID:0000-0001-8223-0915
收稿日期: 2021-08-09
资助项目: 南京市医学科技发展项目(课题)计划(No.ZKX19049)和2019年南京市卫生科技发展专项资金项目(No.YKK19125)联合资助
摘要

目的 通过检测肾综合征出血热疑似患者血清标本中特异性抗体和病毒基因组RNA,了解其基因型别及序列特征。方法 采用胶体金法、荧光定量PCR法、巢式PCR法进行样本检测,对巢式PCR扩增后的阳性产物进行双向测序获得M基因部分片段序列,与各亚型代表株对应序列进行同源性分析并构建系统进化树,确定其基因亚型。结果 122份标本中,IgM阳性27份,阳性率22.1%,IgG阳性57份,阳性率46.7%;荧光定量PCR法检测汉坦病毒核酸阳性13份,阳性率10.7%;15份样本经巢式PCR扩增测序后获得目的片段,其中13株分别属于汉滩病毒H5、H6、H9亚型和汉城病毒S3亚型,另有两株病毒株已形成新的亚型。结论 南京都市圈存在汉滩病毒和汉城病毒流行,其中汉滩病毒存在多种亚型。

关键词: 肾综合征出血热; M基因; 序列分析; 抗体检测
中图分类号:R373.3 文献标志码:A 文章编号:1002-2694(2022)04-0322-05
Serological detection and genotype analysis of Hantavirus isolated from patients with suspected hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in the Nanjing metropolitan area
DONG Xiao-qing, SHI Li-min, WANG Ya-qian, HE Min, DING Song-ning, ZHANG Shou-gang
Nanjing Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210003,China
Corresponding author: Zhang Shou-gang, Email: shougang200716@njmu.edu.cn
Abstract

To investigate the infection status of the population in Nanjing, a total of 122 serum samples from patients with suspected hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) were collected. Through the detection of specific antibodies and viral genomic RNA in these samples, we assessed their genotype and sequence characteristics, and further performed population infection investigation. Samples were detected with the colloidal gold method, fluorescence quantitative PCR and nested PCR. Partial fragment sequences of the M gene were obtained through bidirectional sequencing of the positive products amplified by nested PCR. Homology analysis was conducted with the corresponding sequences of each subtype representative strain, and a phylogenetic tree was constructed to determine the genotypes. The IgM antibody and IgG antibody positivity rates were 22.1% and 46.7% respectively; 13 samples of Hantavirus nucleic acids were analyzed by fluorescence quantitative PCR and showed a positivity rate of 10.7%. A total of 15 samples were amplified and sequenced by nested PCR to obtain the target fragments, among which 13 strains belonged to Hantaan virus subtypes H5, H6, H9 and Seoul virus subtype S3, and two other virus strains had formed new subtypes. Therefore, the Nanjing metropolitan area is a mixed epidemic area with multiple subtypes of circulating HV and the emergence of new subtypes.

Key words: hemorrhagic fever with divine syndrome; M genes; sequence analysis; detection of antibody

汉坦病毒(Hantavirus, HV)属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、正汉坦病毒属(Orthohantavirus), 其基因组包括L、M、S三个片段, 分别编码多聚酶、病毒糖蛋白Gn、Gc和核衣壳蛋白, 可以通过吸入含有病毒颗粒的小型哺乳动物(主要是啮齿动物)排泄物的气溶胶等方式传播给人类[1]。HV在我国主要引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS), 临床上表现为发热、出血及肾功能损伤。汉坦病毒有至少40个血清型/基因型, 能引起HFRS的有7个型[2], 其中汉滩病毒(hantaan virus, HTNV)和汉城病毒(seoul virus, SEOV)为我国HFRS的主要病原体[3]。

汉坦病毒感染危及世界30多个国家和地区, 在我国亦是重大公共卫生问题[4, 5]。本研究抽取南京市部分三甲医院临床诊断为HFRS疑似患者的血清标本, 应用胶体金、荧光定量PCR法、基因测序等方法进行样本检测, 并对病毒基因序列进行分析。

1 材料与方法
1.1 样本来源

2019-2021年南京市鼓楼、中大等三甲医院收治的临床诊断为HFRS疑似患者的血清122份, 患者主要来自于南京及周边区域。

1.2 抗体检测

选用北京贝尔生物工程有限公司生产的汉坦病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金法), 在试剂条加样孔中分别加入待检血清10 μ L和标本稀释液100 μ L, 20 min 内观察结果。只显示对照线为阴性, 对照线和检测线均出现的为阳性, 无对照线的实验结果无效。

1.3 实时荧光RT-PCR检测

选用硕世生物科技有限公司生产的核酸提取试剂, 经过样本裂解、核酸吸附、核酸纯化和核酸洗脱4个步骤获得提取好的核酸。使用该公司生产的汉滩病毒和汉城病毒核酸检测试剂盒, 于PCR反应管中加入按照试剂盒说明书配置好的体系20 μ L, 再分别加入待测样本核酸, 阴性对照, 阳性对照各5 μ L, 设定好扩增参数, 利用实时荧光RT-PCR法对样本进行检测分型。样本Ct值< 37且出现典型的S型扩增曲线, 则判断为阳性。

1.4 M片段部分区域RT-PCR扩增及测序

1.4.1 引物设计与合成 根据《全国肾综合征出血热检测方案》中提供的引物序列, 委托上海生工合成。详见表1。

表1 汉坦病毒巢式PCR引物 Tab.1 Hantavirus nested PCR primers

1.4.2 巢式PCR扩增 使用表1中提供的通用引物(10 μ mol/L)和TAKARA PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒, 按照试剂盒说明书, 以提取好的核酸为模板, 进行第一轮扩增。再以第1轮反应扩增产物为模板, 分别使用HTNV、SEOV 特异性引物(10 μ mol/L)作为巢式引物进行第二轮扩增。反应体系均参照试剂说明书。上述PCR反应扩增条件均为95 ℃预变性10 min, 94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s、扩增35个循环, 72 ℃ 延伸12 min。

1.4.3 电泳与测序 对经过巢式PCR扩增后获得的产物使用毛细管电泳鉴定, Alignment marker选择15 bp~1 kb, Size maker选择50~800 bp。如扩增出的片段大小与预期片段(382 bp和417 bp)大小一致, 则为扩增成功。将该扩增产物委托上海生工完成双向测序。

1.5 基因同源性及系统进化分析

使用 DNAStar 软件包中的 seqman 软件对得到的序列进行拼接及编辑, 从 GenBank 上下载HTNV和SEOV国际标准株、中国代表株以及各亚型代表株(部分毒株资料见表2), 使用MEGA5.0中的 CLUSTAL MUSCLE 程序针对与扩增片段位置相同的 M 片段部分基因进行序列比对, 并构建系统进化树, 使用 MegAlign 软件进行同源性分析。

表2 遗传进化分析部分参考毒株 Tab.2 Sources of reference strains
2 结 果
2.1 疑似患者不同病程3种方法检测结果及确诊情况

本次检测的122份肾综合征出血热疑似病例中有29例经实验室诊断后判定为确诊病例。其中IgM抗体阳性27份, 阳性率22.1%, IgG阳性57份, 阳性率46.7%; HV核酸阳性13份, 阳性率10.7%。对上述确诊病例血清标本进行巢式 PCR 扩增, 14份使用HTNV特异性引物扩增后, 得到与预期目的片段大小(382 bp)一致的阳性扩增条带, 1份使用SEOV特异性引物扩增后, 得到与预期目的片段大小(417 bp)一致的阳性扩增条带。详见表3。

表3 疑似患者不同病程3种方法检测结果及确诊情况 Tab.3 Detection results and diagnosis of patients with different suspected stages of disease through three methods
2.2 M片段的部分基因同源性分析

对15份巢式 PCR 扩增结果为阳性的标本进行双向测序, 所得的序列经过拼接、编辑、校正后, 分别命名为SNJ1-15。与HV国际标准株76-118、80-39, 中国代表株 84FLi、L99 以及疫苗株 Z10、Z37 等毒株的相同位置 M 片段部分基因进行同源性比对, 结果发现 SNJ2-SNJ5 号样本间的核苷酸同源性为94%~97.7%, 与 84FLi 株的核苷酸同源性较高, 为95%~98.3%, 与其他各株核苷酸同源性均低于87.4%。 SNJ6-SNJ12 样本间的核苷酸同源性在97.3%~100%, 与HV114株具有较高同源性, 而与其他各株核苷酸同源性较低。 SNJ1 样本与 Bao14 株的核苷酸同源性较高, 为97.3%, 与其他各株核苷酸同源性均低于90%。 SNJ13、14 号样本与其他样本以及76-118、其他代表株的同源性均小于87.4%。 SNJ15 号样本与 Z37 株核苷酸同源性最高, 为96.3%。详见图1。

图1 SNJ1-15与其他汉坦病毒同源性比较Fig.1 Homology comparison between SNJ1-15 and other hantaviruses

2.3 系统进化树构建

从 GenBank上下载各型HV序列, 与15株 M 片段部分序列比对进行系统进化分析后可见进化树明显分为两支, 其中 SNJ1 与 Bao14 处于同一分支, SNJ2-5 与 84FLi、 SN7 处于同一分支, SNJ6-12 与 HV114 等处于同一分支, SNJ15 与 Z37 处于同一分支, 结合核苷酸同源性分析, 可分别判断为HTNV H6、H5、H9亚型和SEOV S3 亚型。而 SNJ13、14 与各亚型病毒代表株之间的同源性均较低, 结合进化树进化分支推测这2株病毒与HTNV已有的9个亚型存在一定差异, 见图2。

图2 部分M片段核苷酸系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of HV based on partial M segments

3 讨 论

南京都市圈是以南京为中心的经济区域带, 位于长江中下游沿江城市地带核心地区, 该区域受海陆热力性质差异的影响, 为亚热带季风气候, 雨热同期, 有利于农业生产。而 HFRS 的发病与鼠类种群分布、气象因素、生态环境等因素密切相关[6]。南京及镇江、马鞍山等周边地区以丘陵地貌为主[7, 8], 气候湿润, 发病水平较高。在临床表现上, HFRS 与发热伴血小板减少综合征、登革热等疾病在临床症状上均会表现为发热、疼痛、出血倾向, 故难以区分, 需辅助实验室检查加以鉴别。本次研究中疑似患者大多因发热、乏力等非特异性症状就诊, 少部分以胃肠炎、急性肾损伤、胸痛为首发症状, 临床表现复杂多样, 故在临床诊断的基础上开展样本的血清学、病原学检测尤为必要。

HV是有包膜的病毒, 不耐热和耐酸, 也对脂溶剂、酒精、紫外线等敏感, 故在样本运送过程中, 如保存不当容易造成 RNA 的降解。本次研究中有2份标本荧光 PCR 结果阴性, 但经巢式 PCR 扩增后测序, 获得了 M 片段部分基因序列。巢式 PCR 通过使用两对 PCR 引物进行两轮扩增的方法, 不但增加了扩增倍数使得反应灵敏度大大提升, 而且还降低了非特异性扩增导致的污染。所以, 当样本中模板较低的时候, 可以用巢式PCR的方法进行扩增。 HFRS 的发病主要是病毒直接作用所致, 患者发病7~10 d内可检出HV 病毒 RNA[9], 所以, 在发病早期进行核酸检测, 不仅有助于疾病的早期诊断, 病毒载量的高低还关系到疾病的治疗及愈后[10]。但在疾病中后期, 随着抗体的产生, 病毒逐渐减少或被抗体中和, 此时病毒核酸难以检出。本次研究中患者血清IgM从第3 d开始检出, 7~8 d达到高峰, 之后随病程的增加阳性数量逐渐减少, 病毒核酸阳性则集中在发病7 d内, 所以, 需要结合核酸和抗体的实验结果对疑似病人进行实验室诊断。

张守刚[11], 马涛[12]等学者对南京市HFRS流行特征分析结果表明南京市是混合型疫区, 鼠种主要是小家鼠、黄胸鼠和褐家鼠等, 本研究检测到HTNV和SEOV两种病毒株, 与既往研究相符。但此次研究获得的SEOV病毒株数量较少, 究其原因, 可能是之前的研究对象是HV宿主动物, 本研究则针对 HFRS 疑似患者, 且 SEOV 引起的 HFRS 多为轻症且病程短[13], 故此型别患者的就诊率较低。

汉坦病毒L、M和S片段中, 变异最大的是M片段, 且由 M 片段编码的包膜糖蛋白 Gn 和 Gc 与病毒的致病性有关, 所以常被用来构建系统进化树和基因分型[14, 15]。有研究表明, HTNV可分为9个亚型, SEOV为4~6个亚型[16]。本研究将获得的部分M片段序列与各亚型代表株构建遗传进化树, 基因分型结果发现除了有13株与已知亚型一致, 另有2株(SNJ13、14)处于 HTNV 大分支下, 但与各已知亚型代表株核苷酸同源性均不高, 表明南京市存在多种不同类型的流行株。在 NCBI 网站上进行 BLAST 序列比对, 发现SNJ14与江西毒株AYW89-15 同源性较高, 为98.5%, 但结合患者流行病学调查发现该患者并未去过江西, 而 GenBank 数据库中江苏省及附近周边地区可用的HV序列较少, 因此, 推测 SNJ14 为本地变异株或省外输入病毒株。而与 SNJ13 最接近的是河南省毒株 2017ZY21M, 同源性为88.3%, 差异较大, 推测为本地变异株。

近年来, 常有HV新亚型的发现, 这些新亚型在致病性上是否存在差异以及疫苗对其是否有保护效果, 这些都需要进一步的研究。本次研究针对M基因的部分片段进行序列比对, 序列片段较短, 下一步将继续对M基因全长进行分段扩增, 找出突变位点, 为临床诊断及疫苗研制提供分子基础。

利益冲突:无

引用本文格式:董晓庆, 石利民, 王雅倩, 等. 南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析[J].中国人兽共患病学报, 2022, 38(4):322-326. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.037

编辑:王晓欢

参考文献
[1] Vaheri A, Strand in T, Hepojoki J, et al. Uncovering the mysteries of hantavirus infections[J]. Nat Rev Microbiol, 2013, 11(8): 539-550. DOI: DOI:10.1038/NRMICRO3066 [本文引用:1]
[2] 周济华, 张海林. 汉坦病毒分型及致病性的研究进展[J]. 国际病毒学杂志, 2008, 15(2): 37-42. DOI: DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2008.02.002 [本文引用:1]
[3] 张琼娜, 段春丽, 张绍琼, 等. 2009-2019年祥云县流行性出血热流行特征分析[J]. 国际病毒学杂志, 2021, 28(1): 28-31. DOI: DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2021.01.007 [本文引用:1]
[4] Zhang YZ, Zou Y, Zhen FF, et al. Hantavirus infections in humans and animals, China[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(8): 1195-1203. DOI: DOI:10.3201/eid1608.090470 [本文引用:1]
[5] 谢渊, 徐鹤峰, 董国英. 肾综合征出血热的概述[J]. 中国医药指南, 2020, 9(18): 38-41. [本文引用:1]
[6] 陈胤忠, 李峰, 徐慧, 等. 2005-2014年江苏省盐城市沿海滩涂地区肾综合征出血热时空分布特征及影响因素研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(6): 477-481. [本文引用:1]
[7] 胡建利, 孟繁岳, 王慎骄, 等. 江苏省2001-2010年HFRS流行特征分析[J]. 现代预防医学, 2013, 40(15): 2761-2763. [本文引用:1]
[8] 王笑辰, 胡建利, 周伟忠, 等. 江苏省2014年肾综合征出行病学分析[J]. 江苏预防医学, 2015, 26(5): 58-60. DOI: DOI:10.13668/j.issn.1006-9070.2015.05.019 [本文引用:1]
[9] Pettersson L, Thunberg T, J Rocklov, et al. Viral load and humoral immune response in association with disease severity in Puumala hantavirus infected patients implications for treatment[J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(3): 235-241. DOI: DOI:10.1111/1469-0691.12259 [本文引用:1]
[10] Yi J, Xu Z, Ran Z, et al. Hantaan virus RNA load in patients having hemorrhagic fever with renal syndrome: correlation with disease severity[J]. J Infect Dis, 2013, 207(9): 1457-1461. DOI: DOI:10.1093/infdis/jis475 [本文引用:1]
[11] 张守刚, 谢国祥, 熊丽林, 等. 南京市2011年主要病媒生物密度、分布与构成情况分析[J]. 现代预防医学, 2013, 40(9): 1749-1751. [本文引用:1]
[12] 马涛, 谢国祥, 徐庆, 等. 2011-2016年南京市肾综合征出血热流行特征分析[J]. 现代预防医学, 2017, 44(23): 4231-4235. [本文引用:1]
[13] Zhang X, Chen HY, Zhu LY, et al. Comparison of Hantaan and Seoul viral in fections among patients with hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) in Heilongjiang, China[J]. Scand J Infect Dis, 2011, 43(8): 632-641. DOI: DOI:10.3109/00365548.2011.566279 [本文引用:1]
[14] 丁晓华, 杨占秋, 肖红, 等. 汉坦病毒M 片段的核苷酸序列变异和系统发生树分析[J]. 病毒学报, 2003, 19(2): 169-172. DOI: DOI:10.3321/j.issn:1000-8721.2003.02.016 [本文引用:1]
[15] 张永振, 屈勇刚, 杨东明, 等. 汉坦病毒系统发生分析及其基因分型的研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 22(3): 193-197. DOI: DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2006.03.001 [本文引用:1]
[16] 王世文, 杭长寿, 王华, 等. 我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分布研究[J]. 病毒学报, 2002, 18(3): 211-216. DOI: DOI:10.3321/j.issn:1000-8721.2002.03.004 [本文引用:1]